B型肝炎病毒表面抗原基因中止型突变的侦测技术的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明原则上系关于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma)，特别是与B型肝炎 病毒有关的肝细胞癌。
【背景技术】
[0002] B型肝炎病毒表面抗原基因 （Gene S of hepatitis B virus)负责编码表面抗原 HBsAg。该B型肝炎病毒表面抗原基因 （HBsAg gene)为一个长的开放转录区（long open reading frame)，但该转录区内有3个起始密码子（start codon, ATG)，进而将该HBsAg 基因分成3个部份一pre-Sl、pre-S2和S。因为具有多个起始密码子，该基因负责编码的 多胜肽共有3种不同的大小一大（large)S、中（middle)S和小（small)S ;其中大S是由 pre-Sl+pre-S2+S来编码，中S是由pre-S2+S来编码，小S是由S来编码。在慢性B型肝炎 感染的过程中，病毒基因组经常会发生突变。这些突变是因为这些病毒试图要逃脱寄主的 免疫监视（host immune-surveillance) 〇
[0003] B型肝炎病毒相关的肝癌变（Hepatocarcinogenesis)被认为是一种打带跑 (hit-and-run)的事件，因为大部分手术移除的肝癌癌组织中，很少发现有可自由复制的病 毒的存在。因此，若是有某种病毒突变被认为和癌症发生的过程有关，但常无法被确认，这 是因为突变病毒在肝癌形成的后续阶段中已经不存在了。
【发明内容】
[0004] 本发明系关于一种于体外侦测一分离出的核苷酸检体具有一 B型肝炎病毒表面 抗原基因 C端截断突变（c-terminal truncation mutation)的方法，其中该表面基因负责 编码一小表面蛋白质（small S protein)，而该方法包括下列步骤：
[0005] a)提供第一组引子（first primer pair)和第二组引子（second primer pair):其中该第一组引子包括一第一前置引子（first forward primer)和一反置引子 (reverseprimer);其中该第二组引子包括一第二前置引子（second forward primer)和一 反置引子（reverse primer);另，（1)该第一前置引子包括：一段会黏合（annealing)至S 基因5'端（5'-end)的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'端标记有一 FLAG标记序列（FLAG tag sequence);该反置引子具有可黏合至S基因3'端（3'-end)序列的特征；该第一组引 子具有产生第一次PCR产物的特征，该第一次PCR产物于5'端包括一 FLAG标记序列；（2) 该第二前置引子由5'端至3'端的方向（5'~3'direction)包括一 T7或Sp6启动子序列、 一 Kozak序列（Kozak sequence)、一 3'端序列，且该3'端序列可黏合至第一次PCR产物 5'端的FLAG标记序列；而该第二组引子具有产生第二次PCR产物的特征，该第二次PCR产 物包括其5'端具有T7或Sp6启动子序列，具有Kozak序列和FLAG标记序列，其中该Kozak 序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
[0006] b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括一分离出的核苷酸检 体和第一组引子来产生第一次PCR产物，其中该分离出的核苷酸检体来自于B型肝炎病毒 带原者（HBV carrier)或B型肝炎病毒疑似带原者；
[0007] c)于第二反应混合物中进行一第二次PCR:该混合物包括第一次PCR产物和第二 组引子来产生第二次PCR产物；
[0008] d)将第二次PCR产物转译成一蛋白质；
[0009] e)将该蛋白质的尺寸（size)与控制组或野生型的小表面蛋白质做比较；及 [0010] f)决定该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因的C端截断突变：该蛋白质与控 制组或野生型的小表面蛋白质做比较，若其尺寸较小，则该检体具有B型肝炎表面基因的C 端截断突变。
[0011] 另一方面，本发明系关于一种于体外侦测一核苷酸检体至少具有一个B型肝炎病 毒表面抗原基因 C端截断突变的方法，该方法包括下列步骤：
[0012] a)提供一第一前置引子和一反置引子；其中该第一前置引子包括一段用于黏合 至S基因5'端（5'-end)的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'端具有一 FLAG标记序列；该 反置引子具有一用于黏合至S基因3'端（3'-end)的核苷酸序列；
[0013] b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括该核苷酸检体、该第 一前置引子和该反置引子来产生一第一次PCR产物；其中该第一次PCR产物包括于其5'端 具有的FLAG标记序列；其中该核苷酸检体来自于人类B型肝炎病毒带原者或人类B型肝炎 病毒疑似带原者；
[0014] C)提供一第二前置引子和反置引子，该第二前置引子由5'端至3'端方向包括一 T7或Sp6启动子序列、一 Kozak序列（具有一空间子（spacer)及一 3'端序列，该3'端序 列具有黏合至第一次PCR产物5'端FLAG标记序列的特征；
[0015] d)于第二反应混合物中进行一第二次PCR，该第二反应混合物包括第一次PCR产 物、第二前置引子和反置引子来产生第二次PCR产物；该第二次PCR产物包括在其5'端的 T7或Sp6启动子序列、该Kozak序列和该FLAG标记序列，其中该Kozak序列位在T7或Sp6 启动子序列及FLAG标记序列之间；
[0016] e)将第二次PCR产物转译成一蛋白质；
[0017] f)将该第二次PCR产物转译的蛋白质的尺寸与野生型小表面蛋白质做比较；及
[0018] g)当该蛋白质的尺寸比野生型小表面蛋白质小，即可确定该核苷酸检体具有B型 肝炎表面基因的C端截断突变。
[0019] 再另一方面，本发明系关于一种用于体外侦测一核苷酸检体具有一 B型肝炎表面 基因 （hepatitis B virus (HBV) surface(S)gene)的C 端截断突变的诊断套组（diagnostic kit)，该诊断套组包括：
[0020] a) -第一组引子，该第一组引子具有可黏合至第一次PCR的核苷酸检体中的B型 肝炎表面基因以产生第一次PCR产物的特征；其中该第一次PCR产物延展（spanning) B型 肝炎表面基因序列，至少从氨基酸序列SEQ ID NO:2的氨基酸位置123至227进行一小表 面蛋白质的编码，且该第一次PCR产物于其5'端标记有一 FLAG标记序列。
[0021] b) -第二组引子，该第二组引子具有在第二次PCR黏合至第一次PCR产物来产生 第二次PCR产物的特征；该第二次PCR产物延展（spanning)第一次PCR产物的序列，且第 二次PCR产物包括一位于5'端的T7或Sp6启动子序列、一 Kozak序列和该FLAG标记序列； 其中该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间。
[0022] 在本发明一实施例中，B型肝炎表面基因的C端截断突变系选自于sL15*、sL21*、 sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196* 及 sL216*。
[0023] 在本发明另一实施例中，该蛋白质尺寸的比较步骤是以西方点墨法（western blot)或化学发光侦测系统（chemiluminescent detection system)来进行。
[0024] 在本发明另一实施例中，该核苷酸检体系取自于疑似被B型肝炎病毒感染或具有 肝细胞癌的病患、或肝功能不正常或肝硬化的病患。
[0025] 在本发明另一实施例中，该核苷酸检体系取自于一新鲜的冷冻肝组织、福尔马林 固定石蜡组织切片或血液样本。
[0026] 在本发明另一实施例中，该第一次PCR产物延展（spans)B型肝炎表面基因，至少 从氨基酸序列SEQ ID N0:2的氨基酸位置123至227进行一小表面蛋白质的编码，且该第 一次PCR产物于其5'端标记有一 FLAG标记序列。
[0027] 在本发明另一实施例中，该第一次PCR产物延展（spans)B型肝炎表面基因，从氨 基酸序列SEQ ID NO:2的氨基酸位置30至227或从氨基酸序列SEQ ID NO:2的氨基酸位 置123至227进行一小表面蛋白质的编码。
[0028] 在本发明另一实施例中，该Kozak共有序列（Kozak consensus sequence)为SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6。
[0029] 在本发明另一实施例中，前述的体外诊断套组中的第一组引子包括一第一前置引 子和一反置引子；诊断套组中的第二组引子包括一第二前置引子和该反置引子；其中（1) 该第一前置引子的5'端包含一 FLAG标记序列；(2)该第二前置引子由5'端至3'端的方 向包括该T7或Sp6启动子序列、该Kozak序列、及一 3'端序列（3' -end sequence)，且该 3'端序列具有黏合至第一次PCR产物5'端FLAG标记序列的特征。
[0030] 在本发明另一实施例中，前述的引子如下所列：
[0031] a)该第一组引子对的第一前置引子包括一核苷酸序列，该核苷酸序列系选自于 SEQ ID N0:8、ll、13、14 和 16 ;
[0032] b)该第二组引子对的第二前置引子包括一核苷酸序列，该核苷酸序列系选自于 SEQ ID NO:10、12、15 和 17 ;及
[0033] c)该反置引子包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
[0034] 在本发明另一实施例中，该第一前置引子和该第二前置引子包括分别选自于以下 组合的核苷酸序列：
[0035] (a) SEQ ID NO: 8 和 10 ;
[0036] (b) SEQ ID NO: 11 和 12 ;
[0037] (c)SEQ ID NO:8 和 12 ;
[0038] (d) SEQ ID NO: 13 和 12 ;
[0039] (e) SEQ ID NO: 13 和 10 ;
[0040] (f) SEQ ID NO: 14 和 12 ;
[0041] (g) SEQ ID NO: 14 和 15 ;
[0042] (h) SEQ ID NO: 14 和 10 ;及
[0043] (i) SEQ ID NO: 16 和 17。
[0044] 再于本发明另一实施例中，该第一前置引子的核苷酸序列为SEQ ID NO: 14,且该 第二前置引子的核苷酸序列为SEQ ID NO: 15。
[0045] 又于本发明另一实施例中，前述的引子如下所列：
[0046] a)该第一组引子对的第一前置引子的核苷酸序列系选自于SEQ ID N0:8、ll、13、 14 和 16 ;
[0047] b)该第二组引子对的第二前置引子的核苷酸序列系选自于SEQ ID NO: 10、12、15 和17 ;及
[0048] c)该反置引子由SEQ ID NO:9的核苷酸序列组成。
[0049] 上述实施例仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以的限定本发明实施的范围， 即大凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利涵盖的范围内。
[0050] 图式阐释的仅为本发明的一或多个实施例，且图式与文字说明所阐释的为本发明 的主要原理。
[0051] 只要许可，图式中若使用到相同的图