多肽多孔质体及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以来自蛛丝蛋白质的多肽为原料的多肽多孔质体及其制造方法。
【背景技术】
[0002] 多肽水凝胶在人工软骨等生物体材料等中被使用。在专利文献1中提出了一种将 丝素蛋白溶解于聚乙二醇等的吸湿聚合物的水凝胶或发泡体。在专利文献2中公开有一种 以蜘蛛丝为原料、进行光交联的凝胶。 现有技术文献 专利文献
[0003] 专利文献1:日本特表2007-515391号公报 专利文献2:日本特表2008-506409号公报
【发明内容】
发明所要解决的课题
[0004] 但是，现有法中所提出的溶剂的尿素水溶液，其溶解蛛丝蛋白质的力弱，胍水溶液 或六氟异丙醇（HFIP)等价格昂贵，且溶剂残存时，难以适用于生物体。另外，关于现有的丝 素蛋白的发泡体，水分吸收性不清楚。
[0005] 本发明为了解决上述现有的问题，提供一种水分吸收性优异的多肽多孔质体，另 外，提供一种对生物体的适用优异的多肽多孔质体及其制造方法。 用于解决课题的技术方案
[0006] 本发明的多肽多孔质体为来自蛛丝蛋白质的多肽多孔质体，其特征在于，所述多 肽含有非水溶性多肽，表观密度为〇. lg/cm3以下。
[0007] 本发明的多肽多孔质体的制造方法的特征在于，包括：使来自蛛丝蛋白质的多肽 溶解于选自由下述（A)~（C)构成的组中的至少一种溶解用溶剂而得到多肽的溶液的溶液 生成工序；通过将所述溶液生成工序中生成的溶液替换为水溶性溶剂而得到多肽凝胶的工 序；和将所述多肽凝胶进行干燥的工序。 ㈧二甲基亚砜 (B) 在二甲基亚砜中加入有无机盐的溶液 (C) 在N，N-二甲基甲酰胺中加入有无机盐的溶液 予以说明，在此所说的"使多肽溶解于溶解用溶剂"包含使多肽完全溶解于溶解用溶 剂、和通过使多肽的微粒分散于溶解用溶剂中而成为使多肽的微粒实质上溶解于溶解用溶 剂的形态这两者。以下，在相同的意义中使用。 发明效果
[0008] 本发明在制作多肽溶液时使用特定的溶剂，通过替换为水溶性溶剂而取得多肽凝 胶并进行干燥，由此可以制造几乎不含有残存溶剂或残存溶液非常少的多肽多孔质体，由 此，可以提供对生物体的适用优异的多肽多孔质体。另外，本发明的多肽多孔质体通过表观 密度充分地缩小而内部的空隙量增大，因此，发挥高的水分吸收性。该多孔质体也称为干凝 胶（xerogel)，为在固相的骨架中具有空隙的网眼结构体。此外，本发明中使用的溶剂为在 丙烯酸系纤维或聚酰亚胺的制造中所使用的溶剂，也具有成本廉价的优点。
【附图说明】
[0009] 图1是本发明的一实施例的多肽多孔质体的光学照片。 图2是本发明的一实施例的多肽多孔质体的扫描型电子显微镜（SEM)的倍率70的照 片。 图3是本发明的一实施例的多肽多孔质体的扫描型电子显微镜（SEM)的倍率200的照 片。 图4是本发明的一实施例的多肽多孔质体的扫描型电子显微镜（SEM)的倍率1，000的 照片。
【具体实施方式】
[0010] 本发明的蛋白质使用来自蛛丝蛋白质的多肽。来自蛛丝蛋白质的多肽只要是来自 天然型蛛丝蛋白质或类似的多肽即可，没有特别限定。例如包含天然型蛛丝蛋白质的变异 体、类似体或衍生物等。从坚韧性优异的观点出发，上述重组蛛丝蛋白质优选为来自蜘蛛的 大壶状腺中产生的大吐丝管牵引丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质。作为上述大吐丝管牵引丝蛋 白质，可列举来自美国络新妇蛛（Nephila clavipes)的大壶状腺丝蛋白MaSpl或MaSp2、来 自十字圆蛛（Araneus diadematus)的 ADF3 或 ADF4 等。
[0011] 另外，上述重组蛛丝蛋白质可以为来自蜘蛛的小壶状腺中所产生的小吐丝管牵 引丝的重组蛛丝蛋白质。作为上述小吐丝管牵引丝蛋白质，可列举来自美国络新妇蛛 (Nephila clavipes)的小壶状腺丝蛋白 MiSpl 或 MiSp2。
[0012] 此外，上述重组蛛丝蛋白质可以为来自蜘蛛的鞭毛状腺（flagelliform gland)中 所产生的横丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质。作为上述横丝蛋白质，可列举例如来自美国络新 妇蛛（Nephila clavipes)的鞭毛状丝蛋白质（flagelliform silk protein)等。
[0013] 作为来自所述大吐丝管牵引丝蛋白质的多肽，可列举含有式I :REP1-REP2(1)所 示的氨基酸序列的单元2个以上、优选4个以上、更优选6个以上的多肽。予以说明，在来 自所述大吐丝管牵引丝蛋白质的组多肽中，式（I) :REP1_REP2(1)所示的氨基酸序列的单 元可以相同，也可以不同。上述式（1)中，REPl是指聚丙氨酸。在所述REPl中，连续排列 的丙氨酸优选为2残基以上，更优选为3残基以上，进一步优选为4残基以上，特别优选为5 残基以上。另外，在所述REPl中，连续排列的丙氨酸优选为20残基以下，更优选为16残基 以下，进一步优选为14残基以下，特别优选为12残基以下。上述式（1)中，REP2为由10~ 200残基的氨基酸构成的氨基酸序列，所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、 脯氨酸及丙氨酸的总计残基数相对于氨基酸残基数整体为40%以上，优选为50%以上，更 优选为60%以上。
[0014] 在大吐丝管牵引丝中，所述REPl相当于在纤维内形成结晶β片材的结晶区域，所 述REP2相当于在纤维内更具有柔软性、且大部分欠缺有规则的结构的无定型区域。而且， 所述[REP1-REP2]相当于由结晶区域和无定型区域构成的重复区域（重复序列），为牵引丝 蛋白质的特征的序列。
[0015] 作为含有上述式I :REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元2个以上的多肽，可 列举例如具有序列号1、序列号2、序列号3及序列号4中的任一序列号所;^的氨基酸序列 的来自ADF3的重组蛛丝蛋白质。序列号1所示的氨基酸序列相当于在从NCBI数据库中获 得的ADF3的部分的氨基酸序列（NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI :1263287)的N末 端附加有由起始密码子、HislO标签及HRV3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C蛋白酶）识别 位点构成的氨基酸序列（序列号5)的氨基酸序列的从第1残基至第631残基的氨基酸序 列。序列号2所示的氨基酸序列为在N末端附加有由起始密码子、HislO标签及HRV3C蛋 白酶（Human rhinovirus3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列（序列号5)的ADF3的氨 基酸序列（NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI :1263287)中，使第1~13号的重复区 域以成为大约2倍的方式增加，同时以在第1154号氨基酸残基上终止的方式使翻译变异的 氨基酸序列。序列号3所示的氨基酸序列为在从NCBI数据库中获得的ADF3的部分的氨基 酸序列（NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI :1263287)的N末端附加有由起始密码子、 HislO标签及HRV3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列 (序列号5)的氨基酸序列。序列号4所示的氨基酸序列为在N末端附加有由起始密码子、 HislO标签及HRV3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列 (序列号5)的ADF3的氨基酸序列（NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI :1263287)中， 使第1~13号的重复区域以成为大约2倍的方式增加的氨基酸序列。另外，作为含有上述 式I :REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元2个以上的多肽，可以使用包含在序列号1、 序列号2、序列号3及序列号4中的任一序列号所示的氨基酸序列中1个或多个的氨基酸被 替换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列、且具有由结晶区域和无定型区域构成的重复区 域的多肽。
[0016] 本发明中，"1个或多个"是指例如1~40个、1~35个、1~30个、1~25个、1~ 20个、1~15个、1~10个、或1个或数个。另外，本发明中，"1个或数个"是指1~9个、 1~8个、1~7个、1~6个、1~5个、1~4个、1~3个、1~2个、或1个。
[0017] 作为来自上述小吐丝管牵引丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质，可列举含有式2: REP3(2)所示的氨基酸序列的多肽。在上述式2中，REP3是指由（Gly-Gly-Z)m(Gly-Ala) I (A) r构成的氨基酸序列，Z是指任意一个氨基酸，特别优选为选自由Ala、Tyr及Gln构成 的组中的一个氨基酸。另外，m优选为1~4, 1优选为0~4, r优选为1~6。
[0018] 在蛛丝中，小吐丝管牵引丝从蜘蛛的巢穴的中心卷绕成螺旋状，作为巢穴的增强 材料使用，或作为包住捕捉的猎获物的丝被利用。已知有与大吐丝管牵引丝相比时，拉伸强 度差，但伸缩性高。其认为是因为，在小吐丝管牵引丝中，许多结晶区域由甘氨酸和丙氨酸 交替地连结的区域形成，因此，与仅由丙氨酸形成结晶区域的大吐丝管牵引丝相比，结晶区 域的氢键容易变弱。
[0019] 作为来自上述横丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质，可列举含有式3 :REP4(3)所示的氨 基酸序列的多肽。在上述式3中，REP4是指由（Gly-Pro-Gly-Gly-