荧光定量pcr检测核酸分子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种荧光定量PCR检测核酸分子的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人类文明持续向前推进，各种病毒接踵而来，从乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV， 到冠状SARS病毒，再到近年的甲型流感H1N1、H3N2,禽流感H5N1、H7N9、H9N2,手足口病毒 EV71、CA16等，每一次病毒爆发和流行都严重威胁到人类的健康，生存及发展，造成重大财 产损失。
[0003] 病毒的检测是人们在与病毒的斗争中重要的技术，当前，病毒检测技术主要包括 病原学、免疫学、分子生物学三个方面。其中，荧光定量PCR检测具有很高的特异性、灵敏性 和重复性，已广泛用于甲型流感、禽流感等病毒的诊断。但是，传统的荧光定量PCR检测方 法通常以纯化的核酸分子（DNA或RNA)为模板，而从样本中提取核酸分子步骤操作复杂。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要提供一种无需从样本中提取核酸分子的荧光定量PCR检测核酸分 子的方法。
[0005] -种荧光定量PCR检测核酸分子方法，包括如下步骤：
[0006] 针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针；
[0007] 将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得所述待检测样本中的病毒核酸分子释 放，得到混合样本；
[0008] 将所述混合样本预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，所述PCR反应预混液 包括所述特异性扩增引物和所述探针；以及
[0009] 将所述反应液置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。
[0010] 在一个实施例中，所述探针为Taqman探针。
[0011] 在一个实施例中，将所述混合样本预热的操作中，所述预热的温度为55 °C~ 70°C，所述预热的时间为IOmin~15min。
[0012] 在一个实施例中，所述蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸 钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。
[0013] 在一个实施例中，所述蛋白质变性液中，异硫氰酸胍的浓度为0. 2mol/L~2mol/ L，柠檬酸钠的浓度为lOmmol/L~30mmol/L，十二烷基肌酸钠的质量浓度为0. 2%~1%， β -疏基乙醇的浓度为0. 05mol/L~0. lmol/L，蛋白酶K的浓度为lmg/mL~5mg/mL。
[0014] 在一个实施例中，所述待检测样本与所述蛋白质变性液的体积比为1 :1~2。
[0015] 在一个实施例中，所述PCR反应预混液还包括PCR反应缓冲溶液和反应酶系；
[0016] 所述PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCU硫酸铵、氯化钾、Tween 20和硫酸镁；
[0017] 所述待检测样本中的病毒核酸分子为DNA时，所述反应酶系包括Taq DNA聚合酶、 dNTPs和BSA ;所述待检测样本中的病毒核酸分子为RNA时，所述反应酶系包括Taq DNA聚 合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
[0018] 在一个实施例中，所述TriS-HCl在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为IOmmol/ L ~65mmol/L ；
[0019] 所述硫酸铵在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为lOmmol/L~20mmol/L ;
[0020] 所述氯化钾在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为40mmol/L~80mmol/L ;
[0021] 所述Tween 20与所述PCR反应缓冲溶液的体积比为(λ 01~2 :100 ;
[0022] 所述硫酸镁在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为2mmol/L~5mmol/L ;
[0023] 所述Taq DNA聚合酶为改良的可抗抑制剂的Taq DNA聚合酶；
[0024] 所述逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特异性的逆转录酶。
[0025] 在一个实施例中，所述待检测样本包括血清、血浆、口鼻腔粘液、尿液和粪便中的 至少一种；
[0026] 所述待检测样本中的病毒包括乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、冠状SARS病毒、甲型 流感HlNl病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
[0027] 在一个实施例中，所述禽流感病毒为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；所述手足 口病毒为EV71和CA16中的至少一种。
[0028] 上述荧光定量PCR检测核酸分子方法，针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列 保守区设计特异性扩增引物和探针，并将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得待检测样 本中的病毒核酸分子释放；混合样本预热后与PCR反应预混液混合并置于荧光定量PCR仪 中进行PCR反应。该检测方法不需要以纯化的核酸分子（DNA或RNA)为模板，待检测样本在 蛋白质变性液的作用下，样本中的病毒核酸分子释放，省去了从样本中提取核酸分子步骤。 同时，PCR反应预混液中含有特异性扩增引物和探针，探针随病毒核酸分子扩增产生荧光信 号，根据荧光信号可实时检测PCR过程。与传统的方法相比，该检测方法无需从样本中提取 核酸分子，直接进行荧光定量PCR检测，具有实验操作简单，可缩短检测周期，节约检测成 本，易于进行高通量检测的优点。特别是，当检测样本较少时，由于不需要从样本中提取和 纯化DNA，该方法也可实现核酸分子的检测。
【附图说明】
[0029] 图1为一实施方式的荧光定量PCR检测核酸分子方法的流程图；
[0030] 图2a为实施例1中阴性对照和阳性对照的荧光定量PCR检测图；
[0031] 图2b为实施例1中内标的荧光定量PCR检测图；
[0032] 图3a为实施例1中平行检测10管含相同浓度HBV病毒核酸分子的纯核酸的荧光 定量PCR检测图；
[0033] 图3b为实施例1中采用本发明提供的方法平行检测10管含HBV的样本的荧光定 量PCR检测图；
[0034] 图4a为实施例1中平行检测8管含相同浓度HBV核酸分子的纯核酸的荧光定量 PCR检测图；
[0035] 图4b为实施例1中采用本发明提供的方法平行检测8管含HBV的样本的荧光定 量PCR检测图；
[0036] 图5a为实施例2中阴性对照和阳性对照的荧光定量PCR检测图；
[0037] 图5b为实施例2中内标的荧光定量PCR检测图；
[0038] 图6a为实施例2中平行检测10管含相同浓度EV71核酸分子的纯核酸的荧光定 量PCR检测图；
[0039] 图6b为实施例2中采用本发明提供的方法平行检测10管含EV71的样本的荧光 定量PCR检测图；
[0040] 图7a为实施例2中平行检测8管含相同浓度EV71核酸分子的纯核酸的荧光定量 PCR检测图；
[0041] 图7b为实施例2中采用本发明提供的方法平行检测8管含EV71的样本的荧光定 量PCR检测图。
【具体实施方式】
[0042] 下面主要结合附图及具体实施例对荧光定量PCR检测核酸分子方法作进一步详 细的说明。
[0043] 如图1所示的一实施方式的荧光定量PCR检测核酸分子方法，包括如下步骤：
[0044] S110、针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探 针。
[0045] 引物的设计可遵循以下原则：引物序列可选取待检测的病毒核酸分子的序列保守 区，不能有碱基变异；检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； 引物的TM值（解链温度）为60°C左右，上游引物和下游引物之间的TM值相差一般不超过 2°C ;引物长度一般为18~25bp。
[0046] 探针的设计可遵循以下原则：探针位置尽可能地靠近上游引物；探针的TM值为 70°C左右，通常比引物的TM值高5~10°C ;探针长度一般为15~45bp ;探针的5'端应避 免使用G (鸟嘌呤），因为5'的G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用， 影响定量；整条探针中，C(胞嘧啶）的含量要明显高于G(鸟嘌呤）的含量，因为G含量高 会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
[0047] 一般的，为确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在序列分析软件中分 析二级结构，并用Blast分析特异性，如果发现有非特异性互补区，需要重新设计引物和探 针。
[0048] 待检测样本中的病毒可以为乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、冠状SARS病毒、甲型流 感HlNl病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
[0049] 具体的，禽流感病毒可以为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；手足口病毒可以为 EV71和CA16中的至少一种。
[0050] 具体的，探针可以为带有焚光基团的物质，如Taqman探针。TaqMan探针是一种寡 核苷酸：5'端标记一个报告焚光基团，3'端标记一个淬灭焚光基团。探针完整时，报告基团 发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶将探针酶切降 解，使报告