水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻〇sLEA5c-l基因在培育抗重金属水稻品 种中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是人类主要粮食作物之一，全世界约有二分之一以上的人食用水稻，有三分 之一以上的人口以水稻为主食。在全世界粮食短缺的今天，生产出足够的稻米对于维持足 够的粮食来说十分重要，如果水稻减产，可能导致饥饿、死亡和社会不稳定。中国人口众多， 是大米生产和消费大国，水稻在国民经济中占有举足轻重的地位。但是，在水稻生产中，干 旱、洪涝、低温、高温、病虫害等逆境因子影响水稻品质、降低水稻产量，造成了巨大的经济 损失。提高水稻的抗逆性、增加水稻产量、改善水稻品质对于保障库区人们的生活、提高人 们的经济收入有着重要的意义。
[0003] 虽然传统的植物育种在改良农作物（如质量性状）的过程中做出了巨大的贡献， 但常规育种在筛选优良品种时难度大、耗时长，已经不能满足水稻生产的需要。近年来，随 着基因工程的迅速发展和转基因技术的日益完善，基因工程育种已成为育种领域的一个重 要分支，在定向改良水稻特性方面也显示出极大的潜力。利用分子生物学手段，克隆水稻 抗逆关键基因，在研宄基因功能的基础上，将基因导入目标水稻品种，定向改良该品种抗逆 性，将是水稻品种改良的一种有效手段，这对提高水稻的抗逆性、增加水稻产量、改善水稻 品质、保障人们的生活、提高人们的经济收入有着重要的意义。
[0004] 水稻0sLEA5c_l基因的核苷酸序列已有文献报道，但迄今为止，还未见利用该基 因在培育抗重金属水稻品种的相关报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻0sLEA5c_l基因在培育抗重金属水稻 品种中的应用；本发明的目的之二在于提供含有水稻0sLEA5c-l基因的植物表达载体在培 育抗重金属水稻品种中的应用；本发明的目的之三在于提供含有水稻0sLEA5c-l基因的微 生物转化体在培育抗重金属水稻品种中的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 1、水稻0sLEA5c-l基因在培育抗重金属水稻品种中的应用，所述水稻0sLEA5c-l 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0008] 优选的，所述水稻品种为水稻中花11号。
[0009] 2、含有水稻0sLEA5c-l基因的植物表达载体在培育抗重金属水稻品种中的应用， 所述水稻0sLEA5c-l基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 优选的，所述水稻品种为水稻中花11号。
[0011] 优选的，所述含有水稻0SLEA5C-1基因的植物表达载体包括水稻0sLEA5c-l基因 表达单元，所述水稻0sLEA5c-l基因表达单元由启动子、水稻0sLEA5c-l基因和终止子。
[0012] 优选的，所述含有水稻0sLEA5c-l基因的植物表达载体是由水稻0sLEA5c-l基因 替换PCAMBIA1301载体上⑶S基因读码框而得。
[0013] 更优选的，所述含有水稻0SLEA5C-1基因的植物表达载体由以下方法制备：
[0014] a.克隆水稻0sLEA5c_l基因：以水稻总RNA为模板，反转获得cDNA第一链，然后 以cDNA第一链为模板，SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩 增，获得带酶切位点的水稻0sLEA5c-l基因；
[0015] b.植物表达载体的构建：将步骤a扩增获得的带酶切位点的水稻0sLEA5c_l基因 分别用NcoI和BstEII双酶切，同时用NcoI和BstEII双酶切pCAMBIA1301载体，然后将酶 切后的水稻0sLEA5c-l基因与pCAMBIA1301载体骨架连接，得含有水稻0sLEA5c-l基因的 植物表达载体。
[0016] 3、含有水稻0sLEA5c_l基因的微生物转化体在培育抗重金属水稻品种中的应用， 所述水稻0sLEA5c-l基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0017] 优选的，所述水稻品种为水稻中花11号。
[0018] 优选的，所述微生物为农杆菌，更优选为根癌农杆菌AGLO。
[0019] 本发明的有益效果在于：本发明首次发现水稻0sLEA5c_l基因具有抗重金属的 功能，因此根据水稻0sLEA5c-l基因的序列特点，选取水稻0sLEA5c-l基因的读码框片段， 构建了水稻0sLEA5c-l基因的植物表达载体，通过农杆菌介导将水稻0sLEA5c-l基因的植 物表达载体转入中花11号中，获得了转基因水稻阳性植株，检测结果显示，转基因水稻阳 性植株中0sLEA5c-l基因的表达较非转基因水稻植株显著增加，转基因水稻阳性植株对 CuS04、HgCljP K 2Cr207的抗性显著增加，说明该植物表达载体可用于抗重金属植物的育种， 在提高植物抗重金属能力、修复重金属污染土壤方面具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图和附 表：
[0021] 图1为0SLEA5C-1基因读码框片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为 DNA分子量标准，1为0sLEA5c-l基因 PCR扩增产物。
[0022] 图2为超表达双元载体pCAMBIA1301-0sLEA5c-l的PCR鉴定图，其中M为DNA分 子量标准，1为以超表达双元载体pCAMBIA1301-0sLEA5c-l为模板获得的PCR扩增产物。
[0023] 图3为超表达双元载体pCAMBIA1301-0sLEA5c-l的酶切鉴定图，其中M为DNA分 子量标准，1为超表达双元载体pCAMBIA1301-0sLEA5c-l的酶切产物。
[0024] 图4为0sLEA5c-l基因植物表达载体pCAMBIA1301-0sLEA5c-l的结构图（LB :左 边界、RB :右边界；T35S :35S终止子；HPT :潮霉素磷酸转移酶基因 ；Pnos :胭脂碱合成酶启 动子；MCS :多克隆酶切位点；P35S :35S启动子；0sLEA5c-l :水稻0sLEA5c-l基因 ；Tnos :终 止子）。
[0025] 图5为转基因阳性植株与非转基因植株基因组DNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电 泳图，其中M为DNA分子量标准，LU L2和L3分别为不同株系的转基因阳性植株，NT为非 转基因植株。
[0026] 图6为转基因阳性植株与非转基因植株的定量RT-PCR图，其中NT为非转基因植 株，LU L2和L3分别为不同株系的转基因阳性植株。
[0027] 图7为CuS04、HgCl# K2Cr2O7处理后的水稻幼苗图，其中NT为非转基因植株，L1、 L2和L3分别为不同株系的转基因阳性植株。
【具体实施方式】
[0028] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0029] 优选实施例中使用的水稻品系为中花11号（Oryza sativa cv. Zhonghua 11)， 质粒PCAMBIA1301 (携带CaMV35S启动子和终止子）和大肠杆菌DH5 α由本实验室保存。 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0试剂盒、限制性内切酶、Taq DNA合成酶等为大连TaKaRa 公司产品。超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）为TIANGEN公司产品。其 余试剂均为进口或国产分析纯试剂。
[0030] 实施例1、水稻0sLEA5c-l基因读码框片段的克隆
[0031] 根据GenBank中查找到的0sLEA5c-l基因候选序列（CT829063)，用序列处理在线 工具包（SMS)生物软件网 http://www.bio-soft.net/sms查找其最大开放阅读框序列，采 用 Primer Premier 5. 0 软件设计引物 0sLEA5c_f :5'-catgccatggtaatggcgcagctggtgg-3' (SEQ ID No. 1，下划线部分为 NcoI 酶切位点）和 0sLEA5c_r :5' -cccggtcaccttagaagacgtc ggagaggg-3'（SEQ ID No·2，下划线部分为BstEII酶切位点）。
[0032] 取不同中花11号水稻幼苗，提取总RNA，然后将提取的总RNA根据TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3. 0试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，再以该cDNA第一链为模板，利用 引物0sLEA5c-f和0sLEA5c-r扩增0sLEA5c-l基因的读码框序列。PCR扩增体系组成为： CldH2O 34 μ L、10X PCR Buffer 5 μ L、MgCl25 μ UdNTP (20 μ M) 2 μ L、上下游引物各 1 μ L、模 板1.(^1^、了&9〇嫩合成酶1以1^，共5(^1^序列扩增条件为94°0预变性21^11;94°0变性 30s、56°C退火30s、72°C延伸lmin，循环35次；最后72°C后延伸lOmin。PCR扩增产物采用 琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，PCR扩增出一条大小为478bp的DNA片段。
[0033] PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化，按照试剂盒说明书 操作。
[0034] 实施例2、水稻0sLEA5c_l基因植物表达载体的构建
[0035] 用NcoI和BstEII双酶切纯化的PCR扩增产物，得到0sLEA5c-l基因的开放 读码框片段，再与经同样双酶切的载体PCAMBIA1301骨架连接，获得植物超表达双元载 体pCAMBIA1301-0sLEA5c