Gdf15受体下游信号因子的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程和分子生物学领域。更具体而言，本发明涉及⑶F15受体下 游信号因子的鉴定及应用。
【背景技术】
[0002] 生长分化因子15 (⑶F15)是转化生长因子β (TGF- β )超家族的一员，具有典型的 TGF-β超家族蛋白结构特点。GDF15在胚胎的生长发育，细胞对压力信号的反应，炎症和组 织损伤后修复的过程中均起着重要作用。TGF-β是一个多功能细胞因子，可以影响多种细 胞的生长、分化及凋亡。在免疫系统中，TGF-β能够诱导Foxp3在⑶4+⑶25-Τ细胞中的表 达，使前〗、6 1'细胞分化为丨!^68。〇^15基因的661^&1^登录号为：匪_004864.2，蛋白的 GenBank 登录号为：NP_004855. 2。
[0003] GDF15在静态细胞中的表达量往往比较低，但是许多细胞压力信号都可以使 GDF15的表达量突然提高，例如在炎症、病毒感染、急性组织损伤等情况下或在肿瘤恶化过 程中。许多信号通路都与GDF15的表达、分泌及其在细胞基质中的储存的调节有关，并调节 ⑶F15的功能。⑶F15的表达受P53、Spl、Sp3、Nkx-2、NF-κ B、AP-I等多个转录因子的调 控，P53对GDF15的调控作用与其在抑制肿瘤转移和促进凋亡方面密切相关。GDF15的启动 子区具有两个P53的结合位点，其启动子激活具有显著的P53浓度依赖性和P53转录结合 位点依赖性。在人卵巢癌和前列腺癌细胞中，GDF15作为P53的下游因子被诱导表达，可以 降低癌细胞的转移。此外，许多其它转录因子也能诱导GDF15在一定类型的细胞中表达，例 如在乳腺癌细胞中，Akt的激活能够上调GDF15的表达。在黑色素细胞中，紫外线照射能够 明显上调⑶F-15的mRNA水平，而在黑色素瘤细胞系中，通过激活MAPK和MITF也能够明显 上调0^-15的1^隱水平。
[0004] ⑶F15通过自分泌和旁分泌的作用发挥抗炎症反应、抑制生长、促进肿瘤细胞凋亡 等功能。作为TGF-β超家族的一员，GDF15可通过依赖或非依赖Smad的方式传导信号，也 可通过激活其它的信号元件来发挥功能，如PI3K/Akt、FAK-RhoA、Ras/MAPKs等。虽然⑶F15 的受体还没有被鉴定出来，但是作为TGF-β超家族的一员，在某些细胞中GDF15能够通过 激活TGF-β的I型和II型受体及细胞内的Smad蛋白复合物来介导细胞的反应。Yi Sun 等证明GDF15蛋白或转染的GDF15能够抑制前列腺癌细胞系的生长，该过程的信号通路与 TGF-β的相似，⑶F15能够对存在完整TGF-β信号通路的癌细胞系的生长起到抑制作用， 但是不能对TGF- β I型和II型受体突变细胞或SmacM失活细胞起到抑制作用。GDF15在培 养的新生儿心肌细胞中的表达能够通过激活Smad2/3的信号通路起到诱导抗心肌肥厚反 应，通过过表达Smad6/7可以消除⑶F15的此种作用。在肝癌细胞中，⑶F15通过Akt及其 下游信号通路的磷酸化来介导其功能。SK Batra等证明在前列腺癌细胞中，⑶F15能够通 过激活FAK-RhoA信号通路，介导肌动蛋白的调整，从而影响癌细胞的迁移。在乳腺癌细胞 中，目前已知⑶F15能够激活ErbB家族受体酪氨酸激酶，并能够通过反式激活ErbB2而激 活Erkl/2和Akt，从而激活乳腺癌细胞的侵袭潜能。
[0005] 综上所述，GDF15在多种癌症的发生发展过程发挥着重要的作用，在癌症发生发展 的不同阶段均发挥着重要的作用，但由于其精确受体目前尚未鉴定，所以在分子机制上研 究GDF15如何发挥其多样性功能至关重要，这将为基础分子免疫研究转化为临床研究，以 及多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种癌症的治疗提供新的药物靶点。此外，Treg细 胞在癌症的发生发展及逃逸过程中均发挥着重要的功能，而TGF- β对调节性T细胞的分化 及功能发挥有着重要的作用。
[0006] 因此，了解作为TGF-β家族的⑶F15蛋白对调节性T细胞作用将有利于进一步研 究GDF15在不同的癌症发展过程通过调节免疫系统发挥的功能。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供⑶F15受体下游信号因子的鉴定及应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种制备生长分化因子15(⑶F15)胞外区的方法，所 述方法包括：
[0009] (1)提供一表达构建物，其从5'至3'端依次包括以下操作性连接的元件：His标 签序列，FLAG标签序列，TEV蛋白酶体识别序列，钙调素结合蛋白（CBP)的基因序列，生长分 化因子15胞外区序列；
[0010] ⑵将步骤（1)的表达构建物与HSP90蛋白的表达构建物共转大肠杆菌（如 Rosetta)细胞，表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区（较佳地，包括二聚体形 式的结构）。
[0011] 在一个优选例中，步骤（2)之后，还包括分离纯化所述带有TAP标签的生长分化因 子15胞外区的步骤。
[0012] 在本发明的另一方面，提供一种表达构建物，其从5'至3'端依次包括以下操作性 连接的元件：His标签序列，FLAG标签序列，TEV蛋白酶体识别序列、钙调素结合蛋白（CBP) 的基因序列，生长分化因子15胞外区序列。
[0013] 在一个优选例中，所述的表达构建物是表达载体。
[0014] 在本发明的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于表达带有TAP标签的 生长分化因子15胞外区，捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白。
[0015] 在本发明的另一方面，提供一种捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白的方法， 所述方法包括：
[0016] (a)利用所述的表达构建物表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区；
[0017] (b)利用His标签，镍柱纯化获得纯化中间物1 ;
[0018] (c)利用Flag抗体，对步骤（b)的产物进一步纯化（如用Protein A/G beads纯 化），获得纯化中间物2 ;
[0019] (d)利用TEV酶酶切纯化中间物2,获得纯化中间产物3 ;
[0020] (e)利用钙调素从中间产物3中捕捉获得终产物，该终产物包括与生长分化因子 15相互作用的蛋白。
[0021] 在一个优选例中，步骤（c)中，以附着有抗Flag抗体的Protein A/G的固相载体 (较佳地为珠（beads))与Flag结合，进行纯化。
[0022] 在一个优选例中，步骤（e)中，以附着有钙调素的固相载体（较佳地为珠（beads)) 与钙调素结合蛋白结合，进行捕捉。
[0023] 在一个优选例中，步骤（e)后，还包括：
[0024] 步骤（f):将捕捉出的复合物质谱鉴定，分析出与生长分化因子15相互作用的蛋 白；和/或
[0025] 步骤（g):通过抑制剂实验和/或基因沉默（knock down)实验确定与生长分化因 子15相互作用的蛋白对于生长分化因子15信号通路的影响。
[0026] 在本发明的另一方面，提供一种蛋白复合物，所述的复合物包括：生长分化因子 15胞外区以及与之结合的下游蛋白，所述的下游蛋白包括：GNAI1，GNB1，MMl，CAMKII， MERTK0
[0027] 在本发明的另一方面，提供生长分化因子15(⑶F15)胞外区的用途，用于体外诱 导naive T细胞分化表达Foxp3为iTreg细胞。
[0028] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0029] 图1A-1C、体外纯化出带有亲和纯化标签的有活性的TAP-tag-ex⑶F15蛋白。
[0030] 图1A、融合表达His标签、FLAG标签、TEV蛋白酶体识别序列、興调素结合蛋白、人 源GDF15蛋白胞外段的构建物结构示意图。
[0031] 图1B、纯化得到TAP-tag-ex⑶F15的电泳鉴定。pET-GDF15(l)为共转化 PGEX-Hsp90质粒后诱导表达，pET-GDF15(2)为单转化质粒表达结果。
[0032] 图1C、将纯化的TAP-tag-ex⑶F15蛋白分别处理293T人胚肾细胞系，检测⑶F15 蛋白活性。
[0033] 图2A-2B、体外纯化有活性的TAP-tag-ex⑶F15蛋白及其点突变失活的对照组蛋 白。
[0034] 图2A、重组表达及镍柱纯化得到TAP-tag-ex⑶F15及TAP-tag-ex⑶F15C273S。相 同条件下得到野生型基因序列正确及突变型拥有一个氨基酸突变的TAP-tag-exGDF15蛋 白。
[0035] 图2B、利用纯化的野生型及突变型TAP-tag-ex⑶F15分别处理293T人胚肾细胞 系，检测蛋白活性。
[0036] 图3TAP-tag_ex⑶F15串联亲和纯化技术路线示意图。
[0037] 图4、TAP-tag-ex⑶F15串联亲和纯化后，纯化出一系列蛋白。I. 6X 109293T人胚 肾细胞系，分为两组，一组为野生型蛋白刺激（实验组8*108细胞），一组为突变型蛋白刺激 (对照组8 X IO8细胞），刺激前细胞做饥饿12h，刺激细胞5分钟后，收集细胞，1000 rpm离 心，弃上清，预冷PBS洗一遍，收集细胞沉淀，裂解细胞，12000rpm离心，收集细胞裂解液，串 联亲合纯化细胞裂解上清（如图3所示技术路线），收集最终蛋白产物，聚丙烯凝胶电泳，进 行银染，将实验组与对照组银染结果相比，取实验组中特异条带进行质谱检测。
[0038] 图5A-5C、利用小分子抑制剂鉴定纯化出的GNB1，MMl，CAMKII等蛋白存在于 ⑶F15的信号通路上
[0039] 图5A、可能存在于⑶F15信号通路上的蛋白及其小分子抑制剂示意图。
[0040] 图5B-C、细胞预处理（饥饿12h)后，先用适宜浓度的小分子刺激后，再做蛋 白刺激，蛋白刺激条件同上所述。1.非刺激；2.单Anismycin刺激30min;3.单PMA 刺激15min ;4.单用野生型ex⑶F15刺激5min ;5. KN-62 (CaMK II抑制剂）刺激Ih ; 6.KN-93(CaMK II抑制剂）刺激 30min;7.GTP14564[Class IIIreceptor tyrosine kinase (RTK)抑制剂刺激 2h ;8. PF562271 (FAK ;RTKs 抑制剂）刺激 30min ;9. PD98059 (MEK 特异性抑制剂）刺激 Ih ;10· CP-724714(ErbB2 抑制剂）刺激 2h ;11· Dynasore(Inhibits GTPase activity of Dynaminl/2)刺激 30min ; 12.单用 IOul DMSO 作为对照（大多 数抑制剂溶于DMS0) ; 13.单用点突变体蛋白刺激5min ; 14. CCR2拮抗剂刺激30min ; 15.6&116111(阻滞(^￥-依赖的细胞活性）刺激301^11;16^1^-8盐酸盐（胞内0 &2+拮 抗剂）刺激Ih ;17· BIBX1382Dihydrochloride(高选择性EGFR-激酶抑制剂）刺激Ih ;