沃尼妙林前药及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药领域，涉及一种前药及其制备方法和检测方法，具体涉及一种沃 尼妙林前药及其制备方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] 沃尼妙林属于截短侧耳素类兽用抗生素，它主要是作用于细菌50S核糖体亚基， 通过抑制肽基转移酶的活性而使细菌蛋白质合成受阻，从而实现抑菌作用。沃尼妙林抗菌 谱广，对G+、G-和支原体菌均有作用，对链球菌、葡萄球菌、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、 猪痢疾短螺旋体、结肠菌毛样短螺旋体、猪胸膜肺炎放线杆菌和细胞内劳森菌等均有较强 的抑制作用，尤其是对支原体和螺旋体属高度敏感。沃尼妙林本身的水溶性和稳定性都很 差，通常需要将其制备成沃尼妙林盐酸盐来提高其水溶性和稳定性。沃尼妙林的盐酸盐水 溶性好，口服吸收快，但其味苦、粉末刺激性强、对光不稳定、吸湿性强、半衰期只有1. 3~ 2. 7小时，不能使药物正常发挥作用，因此制备其缓控释剂型有利于提高药物的稳定性和半 衰期，同时能够使其实现长期药效，减少给药次数。
[0003] 前药（Prodrug)是指具有药理活性的药物与某种化学基团、片段或分子（载体） 经共价键连接形成暂时性键合或永久性键合的化合物。所形成的新化学实体，本身没有活 性，进入人体后，在体内经酶促或非酶促反应会释放出活性原药，从而产生药效。合理的前 药可以增加活性药物在体内的水溶性和代谢的稳定性，酶促或非酶促反应需要时间，因此 会延长药物的作用时间，同时可以借助于前药载体而使药物在某些特定靶组织中定位，减 少副作用，提高药物作用的选择性及疗效。
[0004] 是否可以成功地设计出前药在一定程度上取决于载体分子的选择，所以载体分子 的发展不断地推动着前药的快速发展。聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG)为线性结 构，具有良好的水溶性和生物相溶性，无毒、无免疫性、无致畸性且无抗原性，是获得FDA批 准的药用合成聚合物之一。PEG聚合物是已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物， 当PEG被连接到药物分子上时，便将其本身具有的高度亲水性和较大的水动力学体积等优 良性质赋予给了被修饰的药物分子，改变了药物在水溶液中的溶解性和生物分配行为，高 聚物分子同时在其修饰的药物周围产生较大的空间屏障，减少药物的快速降解，实现缓控 释作用，因此研宄一种具有缓控释作用的沃尼妙林前药具有重要的意义。
[0005] PEG的分子量为2000~75000,分子量比较大，为复杂的混合物，大分子沃尼妙林 的分子量为564. 8,沃尼妙林前药得到的核磁图谱可能难以分析，看不清甚至找不到原来的 结构，因此研宄一种能够检测沃尼妙林前药的方法是具有重要意义的。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题，是提供一种沃尼妙林前药及其制备方法及检测方法， 所提供的沃尼妙林前药具有良好的稳定性，克服了沃尼妙林半衰期只有1. 3~2. 7小 时的缺点，制备的前药具有缓控释作用，体外释放实验显示沃尼妙林前药在8h达到了最大 值。
[0007] 本发明的另一个发明目的是提供了沃尼妙林前药的制备方法，能够制得载药量较 高的沃尼妙林前药。
[0008] 本发明的另一个发明目的是提供了沃尼妙林前药的检测方法，由于沃尼妙林分子 具有多个活性反应位点，沃尼妙林前药制备时PEG/mPEG与沃尼妙林连接的反应位点确定 方法是采用单分子载体与沃尼妙林反应的方法，获得的单分子前药经核磁检测确定沃尼妙 林的反应位点，最终确定获得的前药反应位点为沃尼妙林的2位氨基；并用UV、HPLC-UV和 HPLC-ELSD联用的方法测定PEG-沃尼妙林前药的载药量，测得的载药量更加精准。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 一种沃尼妙林前药，其分子结构如下
其中，所述的PEG或mPEG修饰剂为
[0010] 作为本发明的一种限定，所述的修饰剂中PEG或mPEG的分子量为2000~75000。
[0011] 本发明还提供给了制备上述沃尼妙林前药的方法，它按照以下步骤顺序进行： (I) PEG或mPEG修饰剂的制备 将干燥的PEG或mPEG加到甲苯中，加入吡啶，加热至60°C ; 另将丁二酸酐在60°C下溶于甲苯中； 将溶解后的丁二酸酐缓慢滴入溶解后的PEG或mPEG中，在60 °C反应lh，温度升至80 °C 反应36h; 反应完毕蒸去溶剂，加入饱和NaHCCV^液搅拌30min，乙酸乙酯萃取，水相用稀盐酸 调pH=2~3,二氯甲烷萃取，二氯甲烷层水洗至pH=6~7,干燥，浓缩至1/5溶剂量，然后 向浓缩物中缓慢加入无水乙醚，搅拌30min，降至室温后继续搅拌30min，于0°C下冷冻2h， 过滤，冷冻干燥，得末端羧基的PEG或mPEG衍生物； 将末端羧基的PEG或mPEG衍生物溶于体积比为1:1的DMF和CH2Cl2混合溶剂中，温度 降至0~5°C，加入活化试剂和碱性催化剂反应lh，升至室温反应4~12h，反应完毕，减压 浓缩至1/5溶剂量，向浓缩物中加入无水乙醚，于0°C下冷冻2h，过滤，冷冻干燥，得PEG或 mPEG修饰剂； (2)沃尼妙林前药的制备 将末端羧基的PEG或mPEG衍生物或PEG或mPEG修饰剂溶于体积比为1:1的无水乙 醇和二氯甲烷的混合溶剂中，温度降至〇~5°C，按照顺序分别加入沃尼妙林、二环己基碳 二亚胺和4-二甲氨基吡啶，搅拌30min，自然升至室温，继续搅拌反应12h，反应完毕，加 入10%的HAc溶液，二氯甲烷萃取，合并有机层，水洗至pH=6~7,无水硫酸钠干燥，减压 浓缩至干，向残余物中加入体积比为1:1的甲基叔丁基醚和乙醚的混合溶剂中，室温搅拌 30min，然后在(TC下冷冻4h，过滤，滤饼用体积比为1:1的甲基叔丁基醚和乙醚的混合溶剂 洗涤3次，冷冻干燥，得沃尼妙林前药。
[0012] 作为本发明的一种限定，所述的步骤（1)中PEG或mPEG与丁二酸酐的反应摩尔比 为 1 :2· 5 ~10〇
[0013] 作为本发明的另一种限定，所述的步骤（1)中末端羧基的PEG或mPEG衍生物与活 化试剂的反应摩尔比为1 :4~8 ; 其中，活化试剂为能与末端羧基的PEG或mPEG衍生物形成酸酐、酰氯或酯的化合物。
[0014] 作为上述限定的进一步限定，所述的能与PEG或mPEG衍生物形成酸酐、酰氯或醋 的化合物为：
中的一种。
[0015] 作为本发明的第三种限定，所述的步骤（1)中的碱性催化剂为吡啶、DMAP或Et3N 中的一种。
[0016] 作为本发明的第四种限定，所述的步骤（2)中PEG或mPEG衍生物与沃尼妙林的反 应摩尔比为1 :4~10。
[0017] 本发明采用先用小分子乙二醇单甲醚或乙二醇与沃尼妙林反应，通过核磁图找到 沃尼妙林的反应位点，再参照其反应条件，确定沃尼妙林与大分子的PEG或mPEG的连接位 点。
[0018] 本发明还提供了检测上述沃尼妙林前药的方法，采用单分子载体与沃尼妙林反应 的方法，获得的单分子前药经核磁检测确定沃尼妙林的反应位点，确定前药制备成功后，再 采用UV、HPLC-UV和HPLC-ELSD联用的方法测定PEG-沃尼妙林前药的载药量。
[0019] 首先用HPLC-UV测得沃尼妙林的标准曲线；HPLC-ELSD测得PEG或mPEG、末端羧基 的PEG或mPEG衍生物的标准曲线； 其次用UV测定最终制得的沃尼妙林前药混合物(包括沃尼妙林前药、未反应的沃尼妙 林、PEG或mPEG、末端羧基的PEG或mPEG衍生物）； 最后将UV测定的量减去HPLC-UV测得沃尼妙林的量再减去HPLC-ELSD测得PEG或 mPEG、末端羧基的PEG或mPEG衍生物的量最终得出沃尼妙林前药的量。
[0020] 作为本发明的一种限定，所述的UV条件为：210nm，95%乙醇作为参比溶液； HPLC-UV的条件为：采用的仪器为Waters e2695-2498 ;色谱柱为填料Diamonsil钻石 C18,4. 6X250mm，5 μπι;流动相为体积比为57:43的缓冲盐和乙腈；流速为I. 0 mL/min ;检 测波长为210 nm;进样量样为20 μ L ;柱温为45 °C;其中，缓冲盐为0.94 g磷酸氢二钠和 8. 7 g磷酸二氢钾，加水至1000 mL，用磷酸调节pH2. 5制备而成； HPLC-ELSD的条件为：采用的仪器为Waters e2695-2424 ;色谱柱为填料Diamonsil钻 石C18,4. 6X250 mm，5 μπι;流动相为体积比为50:50的乙腈和水；流速为1.0 mL/min;进 样量样为20 μ L ;柱温为45 °C;ELSD的参数为漂移管温度为60 °C;增益值为250;雾化器 为60%;气压为25 psi。
[0021] 由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于： 本发明所提供的沃尼妙林前药具有良好的稳定性，克服了沃尼妙林半衰期只有1. 3~ 2. 7小时的缺点，制备的前药具有缓控释作用，体外释放实验显示沃尼妙林前药在8h达到 了最大值。本发明所提供沃尼妙林前药的制备方法，能够制得载药量较高的沃尼妙林前药。 本发明所提供沃尼妙林前药的检测方法，由于沃尼妙林分子具有