一种油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物和化学领域，特别涉及油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇 的方法。 二、
【背景技术】
[0002]油橄榄（OleaeuropaeaL.)属木庫科（Oleaceae)、木庫榄属（Olea)常绿乔木，是 世界著名的木本油料树种。橄榄油能大大降低心血管和肺癌的发病率，其营养价值和经济 价值已被大家认可。生物学家进一步发现橄榄叶含有的抗氧化活性成份较之橄榄油更为突 出，主要有橄榄苦苷、羟基酪醇、黄酮类、木酚素类、咖啡酰苯乙醇苷类等多酚类化合物。尤 其是羟基酪醇（Hydroxytyrosol，HT;化学名为3,4_二羟基苯乙醇），清除自由基的能力强， 表现出独特的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流等。而且还能抑制人类 早幼细胞白血病细胞HL60、腺癌细胞HT29及HT29克隆体19A、女性乳腺癌MCF-7细胞等扩 散，透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，具有很好的抗癌活性。
[0003] 天然羟基酪醇在橄榄叶中含量很低，仅有0.01-0. 8%，大多数以酯化物（橄榄苦 苷）的形式存在于油橄榄的各个部位。目前HT主要是从橄榄果、叶，以及在制备橄榄油 或餐用橄榄果过程中产生的残渣和废水中分离的，而废水中橄榄苦苷、女贞苷、毛蕊花苷 等糖苷、黄酮苷及多酚类物质成分复杂，分离效率低。以化学合成HT已有报道，Lucia和 Napolitano等在-25°C下，酪醇经IBX氧化和硫代硫酸钠还原得到HT，收率仅为30%;以3， 4-二羟基苯乙酸作为原料，以氢化铝锂，TMSCHNH/硼氢化钠，四正丁基硼烷化胺/碘甲烷为 还原剂，收率都低于50%，而且原料和催化剂成本昂贵，反应条件苛刻，无法工业化制备。
[0004] 橄榄苦苷（Oleuropein，0E)结构为裂环烯醚类多酚化合物，极易受空气、阳光、 酸、碱、氧化剂、过渡金属离子、长时间高温等因素的影响，发生氧化、缩合、螯合等反应遭受 破坏，尤其是在酸、碱和酶的作用下易降解为HT和榄香酸，如下式所示。
[0005]
[0006] 油橄榄果及叶中OE含量高，尤其在叶中达到10~17%。因此利用油橄榄OE降解 制备天然HT是国内外研宄热点。W02008136037报道酸催化的降解方法需要硫酸催化剂， GhaythRigane对比了酸水解和碱水解橄榄枯饼"alperujo"中OE的化学处理工艺。意大 利研宄人员利用固定化的嗜高温葡萄糖苷酶（pH= 7.0,60°C)降解0E，并从复杂的酶 解混合物中分离出未酶解的〇E、HT和榄香酸。该方法使用的酶价格昂贵，且反应条件必须 是嗜高温。所以进行水解橄榄苦苷的方法研宄显得尤为重要，本研宄关键在于各种水解方 法对橄榄苦苷作用的比较，同时最佳酶解效果和经济适用、条件温和的酶系筛选以及降解 油橄榄叶橄榄苦苷制备羟基酪醇酶解工艺的优化。 三、
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法，本 发明的技术方案是采用如下步骤来实现：
[0008] 3. 1制备方法：
[0009] 酸水解工艺：粗提取物与酸水解液固液比为Ig: 10~100mL，加入为0.lmol/L~ lmol/LHCl溶液，置于30°C~100°C的恒温水浴摇床中。水解Ih~IOh后，中和至中性，过 滤，滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，得到羟基酪醇提取物；
[0010] 碱水解工艺：粗提取物与酸水解液固液比为Ig: 10~100mL，加入0?lmol/L~ lmol/LNaOH溶液，置于30°C~100°C的恒温水浴摇床中。水解Ih~IOh后，中和至中性， 过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，得到羟基酪醇提取物；
[0011] 生物酶法工艺：以橄榄苦苷降解率和羟基酪醇含量为综合考察指标，从中温淀粉 酶、糖化酶、纤维素酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、e-葡聚糖酶、半纤维素酶、单宁 酶、e-葡萄糖苷酶1〇种酶中筛选出降解橄榄苦苷制备羟基酪醇效果最好的半纤维素酶； 通过酶解单因素和正交优化确定最佳工艺条件，制备羟基酪醇提取物。
[0012] 3. 2橄榄苦苷和羟基酪醇HPLC分析方法：称取橄榄苦苷和羟基酪醇对照品配制成 混合溶液，以HPLC峰面积为纵坐标y，橄榄苦苷和羟基酪醇质量（yg)分别为横坐标X，绘 制HPLC标准曲线，得出方程。液相条件为：色谱柱为C180DS色谱柱（250X5mm，5ym)，柱温 为30°C，甲醇：水=35 : 45(0. 2%磷酸）为流动相，进样量IOyL，紫外吸收波长为280nm， 流速为lmL/min。经计算得到橄榄苦苷在0. 441~7. 056yg内与其峰面积呈线性关系，如 图1(a)。并且在此范围内线性回归方程为yi= 1772846. 78Xl+89802. 31，相关系数R21 = 0. 9997。羟基酪醇在0. 5586~8. 9376yg内与其峰面积呈线性关系图I(b)，并且在此范围 内线性回归方程为y2= 1199063. 90x2+119947. 13,相关系数R22= 0. 9996。液相分析橄榄 苦苷和羟基酪醇含量方法的相对标准偏差（RSD)分别为0. 92%和1. 38%，说明其分析方法 精密度较高，重复性好。
[0013] 3. 3羟基酪醇提取物质量评价，称取羟基酪醇提取物溶于甲醇，通过0. 45ym有机 膜滤过，采用HPLC分析，制备的羟基酪醇提取物中羟基酪醇含量2~20%。
[0014] 酸水解和碱水解后的HT含量分别为7. 41%、4. 09%。与酶解最优工艺得到的HT 含量6. 07%相比，盐酸水解的效果略优于酶水解，但NaOH水解OE的效果不好。
[0015] 3. 4酶的筛选：选取中温淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋 白酶、e-葡聚糖酶、半纤维素酶、单宁酶、e-葡萄糖苷酶这1〇种酶。配制pH分别为3. 〇~ 7. 0的磷酸盐缓冲液，称取相同酶活力的各种酶，分别对0. 1~5g油橄榄叶提取物酶解，固 液比为Ig: 10~100mL，并在各种酶的最适温度和pH下酶解2~10h。酶解结束后，90°C 灭酶10min，酶解液在5000r/min离心10min，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，然后进行液相分 析橄榄苦苷和羟基酪醇含量。每次试验进行3次，求其平均值。（0E降解率=1-酶解液OE 质量/提取物OE质量（38.6%) ;HT含量=酶解液HT质量/提取物质量。）以橄榄苦苷降 解率和羟基酪醇含量为综合考察指标，筛选出降解橄榄苦苷制备羟基酪醇效果最好的半纤 维素酶。
[0016] 3. 5单因素实验：取0. 1~5g的油橄榄叶提取物样品置于IOOmL的锥形瓶，加入 10~IOOmL缓冲溶液和10~IOOmg半纤维素酶，在30~80°C下酶解。酶解2~IOh结束 后，90°C灭酶lOmin，酶解液在5000r/min离心lOmin，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，用HPLC 分析滤液中羟基酪醇和橄榄苦苷，并根据标准曲线计算各含量。以橄榄苦苷降解率和羟基 酪醇含量为检测指标，研宄不同因素（温度、PH、时间、加酶量）对半纤维素酶水解橄榄苦苷 效率的影响。每次试验进行3次，求其平均值。
[0017] 3. 6正交实验：在筛选出降解橄榄苦苷制备羟基酪醇效果最好的一种酶的基础 上，考察温度、PH、时间、加酶量四个因不同素对半纤维素酶水解橄榄苦苷效率的影响。在 单因素试验的基础上，为了考察各因素交互作用对油橄榄叶提取物酶解效率的影响及其影 响因素的主次，并得到最佳酶解条件，采用四因素三水平[L9(34)]正交实验设计，分别以温 度、pH、时间、加酶量4个独立变量为考察因素，研宄目标值与影响因素间的关系。
[0018] 根据单因素试验结果，以HT含量为指标，选取了温度、pH、反应时间和酶量进行正 交实验。其结果见表1。
[0019] 表IL9 (34)正交试验设计及结果
[0020] TableIDesignandresultsofL9 (34)orthogonaltests
[0021]
[0022] 由表I中R可看出，对酶解工艺影响因素的大小顺序为温度>pH>时间>酶量， 最佳工艺为A2B3C3D1，即温度60°C，pH= 5. 5,时间6h，酶量40mg。为了检验所得优化条件 的重复性和稳定性，按照此优化条件，进行5次重复试验，HT含量分别为6. 03%、6. 14%、 6. 12%、5. 98%、6. 07,平均值为6. 07%，RSD为1.08%，OE降解率为85. 28%，说明本工艺 相对稳定可行。
[0023] 酸水解和碱水解后的HT含量分别为7. 41 %、4. 09%。与酶解最优工艺得到的HT 含量6. 07%相比，盐酸水解的效果略优于酶水解，但NaOH水解OE的效果不好。
[0024] 本发明通过三种水解方法比较，盐酸水解效果略优于酶水解，但NaOH水解效果不 好。油橄榄叶提取物酶解工艺与其相比，方法条件较温和，整个过程减少了酸、碱催化剂的 使用。
[0025] 本发明采用中温淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 0 -葡聚糖酶、半纤维素酶、单宁酶、e-葡萄糖苷酶10种酶进行筛选，以橄榄苦苷降解率和 羟基酪醇含量为指标，通过HPLC检测，筛选出降解橄榄苦苷制备羟基酪醇效果最好的半纤 维素酶。
[0026] 本发明在酶的筛选基础上，以温度、pH、时间、加酶量为考察因素，为了考察各因素 交互作用对油橄榄叶提取物酶解效率的影响及其影响因素的主次，并得到最佳酶解条件， 采用四因素三水平[L9(34)]正交实验设计，由表2中R可看出，对酶解工艺影响因素的 大小为温度>pH>时间>酶量，可看出最佳工艺为A2B3C3D1,即温度60°C，pH= 5. 5,酶量 40mg，时间6h。为了检验所得优化条件的重复性和稳定性，按照此优化条件，进行5次重复 试验，HT含量分别为6. 03%、6. 14%、6. 12%、5. 98%、6. 07,平均值为6. 07%，相对标准偏 差（RSD)为1. 08%，OE降解率为85. 28%，说明本工艺相对稳定可行。
[0027] 本发明的有益效果表现为：
[0028] 1.油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物酶解工艺与酸水解、碱水解相比，方法条件较温和， 整个过程减少了酸、碱催化剂的使用；
[0029] 2.通过比较可能断裂糖苷键的各种生物酶对橄榄苦苷的降解效果和羟基酪醇的 含量，得出半纤维素酶降解油橄榄叶提取物制备羟基酪醇的效果最好；
[0030] 3.优化半纤维素酶降解油橄榄叶粗提取物制备羟基酪醇的工艺，羟基酪醇含量可 得到6. 07%。 四、【附图说明】
[0031] 附图1羟基酪醇和橄榄苦苷标准曲线；
[0032] 附图2酶的种类对油橄榄叶粗提取物酶解效率的影响
[0033] 附图3酶解单因素对油橄榄粗提取物橄榄苦苷降解和羟基酪醇生成的影响；
[0034] 附图4羟基酪醇和橄榄苦