来自菜豆壳球孢菌的木质素降解酶及其用图
【专利说明】来自菜豆壳球孢菌的木质素降解酶及其用途
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求保护2012年8月16日提交的美国临时专利申请序号61/683913的优 先权权益，其内容通过引用结合到本文中。 发明领域
[0003] 本发明涉及菜豆壳球孢菌的木质素降解蛋白/酶和基因。更具体地讲，本发明公 开了这些蛋白的核苷酸序列并促进木质纤维素材料的木质素含量降低。本发明还涉及从菜 豆壳球孢菌中选择并分离能够降解木质素的酶的方法、克隆来自菜豆壳球孢菌的基因片段 的方法和使用所述基因片段的酶产物的方法。特定地讲，其可用于制造或加工纸浆、木浆、 甲醇和纺织品。
[0004] 发明背景
[0005] 木质素是仅次于纤维素的第二丰富的有机聚合物。其与纤维素纤维结合，构成 干木材重量的约四分之一。该芳族聚合物抗拒降解。木质素经由许多类型的键与在细 胞壁中的半纤维素共价连接。在键合之中，最丰富的木质素亚结构为芳基醚，其占 内苯基丙烷键的约 40 % (Higuchi T 1990. Lignin biochemistry:biosynthesis and biodegradation. Wood Sci. Technol. 24:23-63)。另外，木质素不具有像例如纤维素、蛋白 质、淀粉等其它生物聚合物一样的任何重复单元。醚键常常是普遍存在的，提供与许多芳族 残基的多种键合。这些结构特点决定着在木质素降解方面的局限性。典型结构的一部分在 图1中说明并且在该图中的芳基甘油醇芳基醚结构红色是数量上最重要的键合，构成 该聚合物的至少40%。但是，木质素的生物降解是由植物原料加工生物燃料和木浆的先决 条件。木质素降解的改进将驱动生物燃料加工产量，实现更好的增益或更好的效率因子。
[0006] 木质素是木质纤维素的一种组分，必须将其降解以允许有效使用纤维素材料来糖 化、造纸、生物燃料制造或粗饲料升级。木质纤维素降解为包括水解酶和氧化酶两者的多酶 过程。通常，木质素由三种主要的构筑嵌段，即对羟基肉桂醇、松柏醇和芥子醇构成。另外， 草和双子叶植物木质素还含有大量的酚酸，例如对羟基肉桂酸和阿魏酸，它们与醇基酯化。
[0007] 木质素过氧化物酶（LiP)、锰过氧化物酶（MnP)和漆酶是在木质素的生物降解 中包括的三个酶家族。LiP通过抽出一个电子并产生阳离子基团而氧化非酚木质素亚结 构(Kirk TK, Tien M, Kersten PJ, Mozuch MD 和 Kalyanaraman B 1986. Ligninase of Phanerochaete chrysosporium. Biochem J 236:279-287 ;Kirk TK 和 Farrell RL 1987. Enzymatic "combustion" ：The microbial degradation of lignin. Annu Rev Microbiol 41:465-505)，且MnP将酚环氧化成苯氧基，导致木质素分解（Gold MH, Wariishi H和 Valli K 1989. Extracellular peroxidases involved in lignin degradation by the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. In:Biocatalysis in Agricultural Biotechnology,第127-140页，由Whitaker JR和Sonnet PE编辑.American Chemical Society, Washington, DC)。而漆酶能够氧化木质素的酷部分和非酷部分两者， 而且后者取决于共存的初级漆酶底物（Bourbonnais R和Paice MG 1990.0 xidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation. FEBS Lett 267(1):99-102)。图2显示代表在由LiP氧化时经受Ca-Ce裂解的主要 芳基甘油醇β-芳基醚木质素结构的二聚模型化合物（Kirk等，1986. Ligninase of Phanerochaete chrysosporium. Mechanism of its degradation of the non-phenolic arylglycerolβ -aryl ether substructure of lignin. Biochem J 236:279-287)〇
[0008] 近年来，关于木质素生物降解的研究大大增加。特别是自从发现第一木质纤 维素降解真菌黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)以来，出于对木质 素的生物降解的意义而将基因组定序（Martinez等，2004. Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78. Nature Biotehnol22 (6) :695-700) ^可能最好的研究是通过白腐真菌黄孢原毛平革菌 降解在木质纤维素中的木质素 （Aust SD 1995. Mechanisms of Degradation by White Rot Fungi. Environ Health Perspect 103:59-61 ;Leisola MSAj Ulmer D 和 Fiechter A 1984. Factors affecting lignin degradation in lignocellulose by Phanerochaete chrysosporium. Arch Microbiol 137:171-175 ;Ulmer D，Leisola M，Puhakka J 和 Fiechter A 1983.Phanerochaete chrysosporium:Growth pattern and lignin degradation. Appl Microbiol Biotechnol 18:153-157 ;Chua MGS，Chen CL, Chang HM 和 Kirk TK 1982. 13CNMR spectroscopic study of lignin degraded by Phanerochaete chrysosporium. I. New structures. Holzforschung 36:165-172) 〇 白腐真菌生成许多 胞外木质素酶，包括血红素依赖性木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和多用途过氧化物 酶及铜依赖性漆酶（Sanchez C 2009. Lignocellulosic residues:biodegradation and bioconversion by fungi. Biotechnol Adv 27:185-194 ;Ten Have R，Teunissen PJM 2001.Oxidative mechanisms involved in lignin degradation by white-rot fungi. Chem Rev 101:3397-3413)。借助于这些胞外过氧化物酶和漆酶，白腐真菌降解木质素 (Timothy DHBj Ahmad Mj Hardiman EM 和 Rahmanpour R 2001.Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Nat. Prod. Rep 28:1883-1896)〇
[0009] 采用植物生物质作为可再生资源的日益增加的意义提供研究木质纤维素的微生 物降解的动力。大量生物质（主要是木质纤维素材料）自林业、农业和食品工业中产生，它 们没有用于副产物加工中。为了有效地利用该植物生物质作为可再生资源，必须研究降解 木质纤维素的备选方法。需要鉴定能够降解木质素以便在由木质纤维素材料生产纤维素产 物的过程中使用的新真菌。
[0010] 为了有效，木质素的降解需要协同作用的几种类型的酶。降解木质素需要至少两 类酶：氧化非酚木质素亚结构的木质素过氧化物酶和氧化酚木质素亚结构和非酚木质素亚 结构两者的漆酶，因此它们可协同地降解。为了获得所提到的酶并使其商业化，需要各种木 质素降解蛋白质的稳定供应。因此，工业上需要全面地鉴定这些木质素降解基因及它们编 码的蛋白质，因此利用遗传信息以便降解来自木质纤维素材料的木质素。
[0011] 发明概述
[0012] 已经意外地发现真菌菜豆壳球孢菌能够生成木质素降解酶，菜豆壳球孢菌与里氏 木霉（Trichoderma reesi)或黄孢原毛平革菌并不密切相关D
[0013] 因此，尤其，本发明涉及可来源于菜豆壳球孢菌的木质素降解酶的鉴定及其对应 用途。本发明还涉及菜豆壳球孢菌真菌在降解纤维素材料的木质素内含物中的用途。
[0014] 本发明的主要目的在于公开编码真菌菜豆壳球孢菌的以下酶的核苷酸序列集：木 质素过氧化物酶（SEQ ID No. 1、2、4、5、7、8和/或其任何混合/组合）、氯过氧化物酶（SEQ ID No. 10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26和/或其任何混合/组合）和血红素过氧 化物酶（haemperoxidase)(SEQ ID 吣.28、29、31、32、34、35、37、38、40、41、43、44和/或其 任何混合/组合）。
[0015] 本发明还公开编码真菌菜豆壳球孢菌的多铜氧化酶的核苷酸序列集（SEQ ID No.46、47、49、50、52、53、55、56、58、59、61、62、64、65、67、68、70、71、73、74、76、77、79、80、 82、83、85、86、88、89、91、92、94、95、97、98、100、101、103、104、106、107、109、110 和 / 或其任 何混合/组合）。
[0016] 优选本发明的分离的多核苷酸由选自包含以下序列和/或由以下序列组成的群 组的核酸序列组成和 / 或构成：SEQ ID No. 2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、 44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、1、4、 7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、 85、88、91、94、97、100、103、106和109和/或其任何混合/组合，其编码选自包含以下序列 和/或由以下序列组成的群组的多肽：SEQ ID No. 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、 39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108 和 111和/或其任何混合/组合。本发明还涉及由上述核苷酸序列的互补序列组成和/或包 含上述核苷酸序列的互补序列的分离的多核苷酸。
[0017] 本发明的另一目的在于提供在所述主要目的中列出的基因和酶的分子生物学和 遗传信息，以用于木质素降解的调节和转化，从而由木质纤维素材料制造有价值的产物。
[0018] 另一方面，为了促进体外制备木质素降解多肽，本发明包括能够表达含有至少 70%的如在以下序列中列出的连续氨基酸的多肽的表达构建体：SEQ ID No. 3、6、9、12、15、 18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、 93、96、99、102、105、108和111。优选所述表达构建体具有具有如在以下序列中所列出的连 续核苷酸的插入的 DNA 或 cDNA :SEQ ID No. 2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、 44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、1、4、 7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、 85、88、91、94、97、100、103、106 和 109。
[0019] 本发明的又一目的公开包含具有在以下序列中列出的核苷酸序列的多核苷酸模 板的重组基因构