一种用于ii、iii期结直肠癌诊断及预后的微小核糖核酸组合及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于II、III期结直肠癌诊断及预后的微小 核糖核酸组合及其应用。
【背景技术】
[0002] 在我国，结直肠癌作为第三大肿瘤，其发病率及死亡率近年来逐年上升。目前在结 直肠癌临床工作中尚有许多亟待解决的问题。第一，尚缺乏有效的用于疾病早期诊断的非 侵入性生物标志物。大便潜血试验及结肠镜检查是目前较为公认的早期诊断方法，多项大 样本临床研宄资料显示，在50岁以上的人群中进行筛查可降低结直肠癌发病率及死亡率。 大便潜血检查因操作方便、成本低廉得到广泛应用，但低灵敏度和特异度使其临床价值有 限。结肠镜检查是目前早期诊断结直肠癌的金标准，但操作难度大、花费高及并发症风险导 致病人依从性差，难以成为人群筛查的常规手段。第二，尚缺乏有效的预后判断及化疗疗效 评价指标。目前临床上主要依据基于临床病理指标（如肿瘤大小、淋巴结转移数目、远处转 移、组织分级等）的TNM分期作为疾病预后的判断及指导临床治疗，但根据此分期判断患者 预后存在较大的异质性，亦不能预测肿瘤患者对化疗的反应。
[0003] 诊断技术的不断提高使新发结直肠癌病例中非转移性疾病的比例大大增加，一 项来自美国的统计显示每年新发结直肠癌患者中IIJII期病人比例超过一半，对于这部分 患者，外科手术及辅助化疗是主要治疗手段。对于淋巴结阳性的局部进展期病人（AJCC III 期），有多项大样本临床试验证明根治性手术以及辅助化疗可显著提高生存，已成为标准治 疗。一般认为，II期患者根治性手术后是治愈的，术后是否进行辅助化疗仍存在争议，目前 认为患者存在高危因素（如T4,脉管侵犯，组织学分化差，梗阻，穿孔等）预示较差的预后并 且可能从化疗中获益，但是这些临床病理指标的明确意义尚未得到大样本资料验证。研宄 表明II、111期结直肠癌患者经过标准治疗后仍有20% - 30%出现复发，其中40 - 50%复发 发生在原发灶切除后一年内，80 %复发发生在原发灶切除三年内，复发后5年生存率低于 1 %。因此，对于这部分病人，寻找有效的预后以及复发预测指标显得尤为重要。
[0004] 微小核糖核酸（microRNA，miRNA)是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小 核糖核酸分子，其主要功能是参与基因转录后水平调控。miRNA通过与靶mRNA 3'端非 翻译序列完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制从而调控靶基因的表 达。miRNA参与1/3人类蛋白编码基因调控，它与多种生理活动有关，如生长发育、细胞增 殖、细胞凋亡、细胞分化等；也与许多疾病的发生发展密切相关，如糖尿病、心血管疾病、月中 瘤等。最近的研宄显示 [1_3]，miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥抑癌基因或癌基因样作用。 已证实，肿瘤组织和肿瘤细胞中的某些miRNA表达水平发生了变化，相对于正常组织，一些 miRNA表达量显著上升或下降。许多癌组织如肺癌、乳腺癌和食管癌等组织都有若干组织特 异性miRNA的表达，提示miRNA有肿瘤组织特异性。另外，miRNA的表达也与肿瘤分化程度 以及预后有关。大量的研宄结果揭示，miRNA可作为新的肿瘤标志物，且为肿瘤的基因治疗 提供新靶点。但组织标本取材属创伤性检出，且无法实现肿瘤的早期诊断和预后判断。最 近报道显示，人血清/血浆中也存在丰富、稳定的miRNA，一些肿瘤包括非小细胞肺癌、结直 肠癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者血清中miRNA表达谱与正常人有显著差异，均有各自 特异的表达谱。
[0005] 目前尚没有利用无创伤性、取材方便的血液标本检测判断与结直肠癌分期相关和 预后相关的特异性miRNA组合及检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就在于通过研宄II、111结直肠癌患者血清miRNA的特异性变化，筛 选出一组与正常人群差异表达并且与肿瘤负荷密切相关的血清miRNA，并利用这些miRNA 的TaqMan探针制备出适用于临床诊疗用途的试剂盒，为结直肠癌分期诊断及术后预后提 供特异性的中间结果以及迅速的无创伤性检测手段。
[0007] 以下是对本发明的
【发明内容】
与技术方案的详细描述：
[0008] -种用于检测II、III期结直肠癌的miRNA组合，该miRNA组合包括下列miRNA : miR - 17、miR - 106a、miR - 145 中的一种或多种；优选由 miR - 17、miR - 106a 和 miR - 145 中的任意两种或三种组成；进一步优选由miR - 17和miR - 106a组成。
[0009] 上述miRNA组合的筛选方法包括以下步骤（见图1):
[0010] (1)分别收集20例手术前II、111结直肠癌患者混合血清，20例手术后II、111结直肠 癌患者混合血清，20例年龄与性别匹配的正常人混合血清，提取总RNA ;
[0011] (2)采用低密度芯片技术（TaqMan low density Array technology)，对上述总 RNA中成熟miRNA进行检测，筛选出3组样本间表达差异的miRNA ;
[0012] (3)用实时荧光定量PCR方法（TaqMan探针法）对上述标本进行逐个检测，从低密 度芯片方法初筛出的miRNA中复筛出表达差异显著miRNA ;
[0013] (4)进一步用定量PCR方法对大批量标本进行逐个验证，筛选出稳定的表达差异 显著的一组miRNA。
[0014] 具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：（1)分别收集正常人及II、m结直肠癌患 者手术前后的混合血清，提取总RNA ; (2)运用低密度芯片技术对上述RNA进行检测，初筛出 手术前后及与非癌对照组表达差异显著的一些miRNA ; (3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，采 用荧光定量PCR (TaqMan探针法）对初筛出的miRNA进行复筛和验证，挑选出手术前后及与 非癌对照组稳定、特异表达的一组miRNA。
[0015] 本发明使用的检测方法可以选自：RT - PCR方法、低密度芯片技术（TaqMan low density Array technology)、Real - time PCR 方法中的一种或几种。例如，血清中 miRNA 分子的检测方法包括以下步骤：
[0016] (1)使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取血清总RNA ;
[0017] (2)通过RNA逆转录反应得到cDNA ;
[0018] (3)利用TaqMan探针法进行PCR反应；
[0019] (4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
[0020] (5)EB染色后在紫外灯下观察结果。
[0021] 本发明还提供了一种用于结直肠癌早期诊断和/或预后诊断的miRNA TaqMan探 针组合物，其包括miR-17、miR-106a和miR-145中的任意两种或三种miRNA的TaqMan探 针，优选由miR -17和miR - 106a两种miRNA的TaqMan探针组成，或由miR - 17、miR - 106a 和miR - 145三种miRNA的TaqMan探针组成，各探针序列进一步优选如下表所示：
[0022]
[0023] 此外，本发明还提供一种用于结直肠癌诊断和/或预后的试剂盒。
[0024] 在本发明的一个具体实施方案中，上述试剂盒包括Taq酶和dNTP，氯化镁、 10XPCR缓冲液（不含Mg 2+)和包括miR - 17、miR - 106a和miR - 145中任意一种或多种 miRNA的TaqMan探针（ABI公司提供，专用于miRNA荧光定量）。
[0025] 上述试剂盒可以优选包括以下TaqMan探针中的一种或多种，进一步优选包括 miR - 17 和 miR - 106a 两种 miRNA 的 TaqMan，或包括 miR - 17、miR - 106a 和 miR - 145 三种 miRNA 的 TaqMan0
[0026]
[0027] 本发明所述结直肠癌包括II、III期结直肠癌。
[0028] 本发明所述的miRNA组合或其对应的TaqMan探针组合，以及含有所述TaqMan探 针组合的试剂盒可用于结直肠癌分期检测和预后判断之中。通过检测本发明所述的miRNA 在患者血清和健康人群血清中的表达量，如果二者具有显著性的差异表达，则说明患者患 有II、111期结直肠癌。通过对患者患病时血清中上述miRNA的定量检测可判断患者的预后 情况。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 首先，血清相对其它组织较易获得，与结肠组织活检相比，属于无创性检查，极大 地方便了医疗人员的使用，更减轻了患者的痛苦；
[0031] 其次，血清中的miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，其检测结果具有精确 而详细的指导意义；
[0032] 第三，所筛选出的miRNA组合对结直肠癌诊断的特异性和灵敏度显著高于目前临 床上使用的肿瘤标志物CEA (癌胚抗原），大大提高了诊断的准确性。此外，血清miRNA检测 能在分子水平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态，并为结直肠癌的治疗提供了潜 在靶点。
[0033] 第四，本发明所筛选出的结直肠癌血清miRNA组合与至今已报道的其他几种肿瘤 患者血清中特异变化的miRNA不尽相同，提示本发明的miRNA组合不仅可以将结直肠癌与 非癌正常人区分开来，同时也与其他肿瘤区分开来。
[0034] 第五，本发明所筛选出的结直肠癌血清miRNA组合与不仅可以将结直肠癌与非癌 正常人区分开来，同时也为结直肠癌术后复发的判断提供帮助。
[0035] 第六，本发明的试剂盒所包含的TaqMan探针同样是基于低密度芯片技术、定量 PCR技术筛选出的在结直肠癌与正常状态下表达差异显著的一组血清miRNA TaqMan探针， 这样可以增加检测的灵敏度和特异性，提高检测水平。
[0036] 综上所述，本发明提供的特异的miRNA组合的检测结果作为诊断结直肠癌的中间 结果，有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行结直肠癌的诊断。同时，此血清 学指标用于II、ΠΙ期患者术后肿瘤复发预后因素具有重要意义，目前临床一些术后复发预 测指标多为组织病理学，取材困难，并且这些指标与疾病复发之间的关系并未得到大样本 验证，缺乏有力证据。我们通过对两个中心的患者血清样本miRNA进行筛选出有效的预测 疾病复发的血清学分子标志物，解决临床目前面临的重要问题，通过在疾病初期筛选出易 复发人群，从而进行更加密切的随访以及给与更强化的治疗。另外，这些miRNAs的发现对 于进一步研宄miRNA与结直肠癌术后复发之间分子了机制研宄、分析miRNA在复发中的作 用、实现靶向miRNA的结直肠癌治疗与实现肿瘤的分子诊断及靶向治疗具有极重要的临床 应用潜力和价值。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明的主要流程图。
[0038] 图2肿瘤负荷的miRNAs诊断指标。
[0039] A图.miR - 145在非癌、术前结直肠癌和术后结直肠癌患者血清中的表达情 况；B图.miR - 17 - 3p在非癌、术前结直肠癌和术后结直肠癌患者血清中的表达情况；C 图.miR - 106a在非癌、术前结直肠癌和术后结直肠癌患者血清中的表达情况。
[0040] 图3 II、III期结直肠癌相关miRNAs的ROC曲线分析。
[0041] A图.术前结直肠癌患者和正常人之间的诊断性分析；B.结直肠癌患者术前和术 后的诊断性分析。
[0042] 图4 miR-17-3p和miR-106a的表达水平在两个中心样本中的生存相关性分析。
[0043] A图.miR -17