一种凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物合成红景天苷的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于固定化酶生产领域，涉及催化合成红景天苷的方法，具体涉及一种凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物合成红景天苷的方法。
【背景技术】
[0002]红景天一般生长于欧亚两州高原地带，为景天科多年生草本或亚灌木植物，具有“高原人参”的美誉。全世界共有红景天属植物96种，主要分布与东亚、中亚、西伯利亚和北美地区。我国有73种，主要分布于西南、西北、华北和东北地区。红景天的主要有效成分为红景天苷，化学名对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是目前研宄最多的红景天中的主要活性成分，是评价红景天品质的主要评价指标。红景天苷具有显著的生物学活性，其效果优于常用的人参和刺五加等中药，在清除机体内过多自由基、抗缺氧、抗衰老、抗心肌缺血、提高机体免疫力等方面具有显著效果，因此能同时发挥防辐射和抗疲劳的双重作用。
[0003]红景天苷的来源目前主要有三种途径，第一为植物来源；第二为化学合成；第三为酶法合成。2004年，Tong等利用苹果籽粉β-葡萄糖苷酶以对羟基苯乙醇和葡萄糖为底物首次进行了合成，反应完成后红景天苷浓度可达11.8g/L，高于化学合成法与植物来源法。因此，酶法成为合成红景天苷的一种有效方法。葡萄糖苷酶广泛地存在于自然界中，在微生物及动植物的体内都发现有该酶的存在。目前，葡萄糖苷酶可应用于改善饮用酒水的风味、生产低聚龙胆糖、水解大豆异黄酮、合成糖苷类化合物以及降解纤维素。但是目前植物来源的葡萄糖苷酶主要是来自于苦杏仁，其价格较高且产量有限，不利于大规模生产应用。
[0004]在实际应用中，游离的酶对外界因素的抗烦扰能力较弱且难于回收利用，而酶的固定化技术作为提高酶稳定性和重复利用性的主要工程手段被广泛地研宄和使用。用于固定化的载体材料有很多，包括天然高分子材料、合成高分子材料、无机材料以及复合材料等，其中凹土(又被称作凹凸棒土)是一种无机材料，其主要成分是一种多孔型链层状镁铝硅酸盐类黏土矿物。凹土这种无机矿物，不仅价廉易得，而且具备机械强度高、热稳定性好、抗有机溶剂、抗微生物腐蚀等优点。交联酶聚合物的制备不需要对酶进行繁琐而复杂的结晶过程，其制备过程简单，原料廉价。综合利用凹土吸附及交联酶聚合物制备的方法可有效地提高固定化酶的稳定性及机械强度，为其提供更广阔的应用空间。
[0005]在固定化酶的技术中，凹土作为酶的载体被广泛使用。申请号为CN201110064051的专利“一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法”，公开号为CN102719498A的专利“有机改性凹凸棒土固载脂肪酶催化剂制备生物柴油的方法”，申请号为CN201110350307的专利“一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法”等专利将凹土用于不同酶的固定化，都获得了良好的应用效果。凹土为各种酶的固定化，提供了一种优良的载体。目前用于合成红景天苷的葡萄糖苷酶并不多见，且产物红景天苷的浓度依然较低，酶活回收率较低，成本高，无法满足工业化生产对经济利益最大化的需求，因此，开发具有更高效率的用于合成红景天苷的β-葡萄糖苷酶以及利用该酶摸索最佳反应条件及具有极大地市场应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于针对现有技术中存在的上述缺点，提供一种凹土负载黑布林籽β -葡萄糖苷酶交联聚合物合成红景天苷的方法，首先自黑布林籽中提取β -葡萄糖苷酶酶液，然后利用吸附-交联法制备凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物，最后利用制备的凹土负载黑布林籽β -葡萄糖苷酶交联聚合物催化合成红景天苷，具有高酶活回收率、良好的稳定性及重复使用性，同时具有产物红景天苷的浓度较高的优点。
[0007]为实现上述目的，本发明采取如下技术方案:
本发明一种凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物合成红景天苷的方法，包括提取黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液、吸附-交联法制备凹土负载黑布林籽β -葡萄糖苷酶交联聚合物和催化合成红景天苷三部分。
[0008]上述凹土负载黑布林籽β -葡萄糖苷酶交联聚合物合成红景天苷的方法，步骤包括:
(1)提取黑布林籽β-葡萄糖苷酶酶液:
1)将黑布林籽去壳、破壁粉碎，得粒径100目的黑布林籽粉，然后按照50g/L加入ΡΗ5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，再加入占黑布林籽粉质量分数I?2%的果胶酶，混合均匀，于40°C恒温震荡培养I?2h，所得溶液离心分离，取上清液真空冷冻干燥，磨粉过60目筛，得干粉;
2)步骤I)干粉中加入25?50倍干粉体积的抽提液，4°C下，搅拌Ih，离心分离，收集提取液，加入提取液质量40%的硫酸铵粉末，搅拌30 min，再次离心分离，取上清液，加入上清液质量65%的硫酸铵粉末，搅拌30 min,第三次离心分离，将第三次离心分离的沉淀溶于缓冲液，溶解浓度为2.65?4.2g/L,静置10?12h，3kDa超滤膜过滤，得到黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液；
(2)吸附-交联法制备凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物:
向步骤(I)黑布林籽β-葡萄糖苷酶酶液中加入酸改性的凹土，黑布林籽β-葡萄糖苷酶与酸改性的凹土质量比为1:20?30，再加入黑布林籽β -葡萄糖苷酶质量0.2%的微晶纤维素，搅拌0.5?Ih ;然后加入沉淀剂，沉淀剂与黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液的体积比为2?4:1，搅拌10?15 min ;然后加入戊二醛，戊二醛加入终浓度为20?40 mmol/L ；8~10°C搅拌交联固化I?2h ;向反应体系中加入蒸馏水终止反应，8000?10000 rpm离心10?15 min，沉淀为凹土负载黑布林籽β -葡萄糖苷酶交联聚合物，4°C保存，备用；
(3)催化合成红景天苷:
磷酸盐缓冲溶液和叔丁醇按照体积比1:4配制混合溶液，然后加入葡萄糖和对羟基苯乙醇，加入浓度分别为0.25mol/L和2.5mol/L,混合均匀，50°C预热30 min ;加入葡萄糖等质量的凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物，混匀，密闭，于恒温振荡器内反应，转速200 rpm，45?55°C反应70?75 h，收集反应液，离心分离，清液即为产物红景天苷。
[0009]步骤(I)中，所述的抽提液为磷酸盐缓冲溶液，浓度为50 mM，pH为7.4 ;
步骤(I)中，溶解沉淀的缓冲液为Tris-HCl缓冲液，浓度为20 mM，pH为7.4 ; 步骤(I)中，制得的黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液的浓度为2.5?4.0g/L ;
步骤(2)中，所述的酸改性的凹土，改性方法为:凹土与2 mol/L的HCl溶液混合，混合浓度0.5g/ml，搅拌12 h，过滤，去离子水洗涤至无Cl —离子，室温真空干燥；
步骤(2)中，沉淀剂为经-20°C预冷的95%乙醇；
步骤(2)中，蒸馏水的体积为整个反应体系体积的5?10倍；
步骤(I)和(2)中，所述的搅拌转速为30r/min ；
步骤(3)中，所述的磷酸盐缓冲溶液，PH为6.0 ;
步骤(3)中，所述的反应，优选50°C反应72 ho
[0010]本发明方法中，反应后凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物可回收，回收处理方式为:收集反应液离心分离出的沉淀，首先用浓度为20 mM，pH为7.4的Tris-HCl缓冲液洗涤3次，再加入1.0 mLPH为6.5的磷酸盐缓冲溶液，振荡使之成为悬浊液，静置10h，离心分离，沉淀为回收的凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物。
[0011]本发明凹土负载黑布林籽β-葡萄糖苷酶交联聚合物合成红景天苷的方法，其有?效果是:
1)本发明采用了食品加工过程中废弃的黑布林籽作为β-葡萄糖苷酶的提取原料，产量大、价格低、易获取，对这些果核回收再利用，可减少环境污染，实现低碳、绿色循环经济；
2)凹土负载黑布林籽葡萄糖苷酶交联聚合物代替游离酶，酶活回收率提高，对环境的耐受度也有明显提高。制备时凹土经过酸改性，戊二醛作用，得到酶蛋白单位浓度较高的固定化酶，同时通过添加微晶纤维素使其具有稳定性好、机械强度高、回收利用次数高的特点。
[0012]3)本发明凹土负载黑布林籽葡萄糖苷酶交联聚合物催化合成产物红景天苷的浓度较高，凹土负载黑布林籽β -葡萄糖苷酶交联聚合物可回收使用，明显提高了酶的利用率，降低了生产成本。此外，反应后凹土负载黑布林籽葡萄糖苷酶交联聚合物经离心即可分离，降低了产物的分离难度