一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体cpb-ban-gfp的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体CPB-BAN-GFP。
【背景技术】
[0002]红豆草(Onobrychis viciaefolia)为豆科驴豆属多年生草本，又称驴喜豆、驴豆，是适口性好且营养价值高的优良牧草，被誉为“牧草皇后” [(I)包桂荣，等.内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2011，6(25):640-642; (2)李素群，等.草业学报，1993，6 (2): 52-55。]。红豆草在各个生长时期，叶片中均可以产生臌胀病防预剂——缩合单宁(CT)，其可使可溶性蛋白质发生凝聚，当反刍家畜采食红豆草后，可防止蛋白质在瘤胃微生物的作用下，剧烈分解产生气体而发生的臌胀病，同时增加了过瘤胃蛋白的含量，提高了牧草的营养价值[李素群，等.草业学报，1993，6(2):52-55。]。缩合单宁生物合成途径是一个较为复杂的过程，有多个酶参与其合成代谢，其中BANYULS(BAN)基因编码的花色素还原酶(Anthocyanidin reductase, ANR)是此合成途径后期的关键酶[Xie D.Y., etal.Science 2003，299 (5605): 396。]，调控BAN基因的表达水平可以改变CT的积累。BAN基因首先在拟南芥中被分离和验证，在烟草和拟南芥中超量表达该基因均导致单宁的大量积累和花色素合成的减少，暗示植物中花色素和单宁合成途径之间可能相互影响[De-YuXie, et al.Archives of B1chemistry and B1physics, 2004，422 (I) 91-102]。最新的研宄发现，在烟草中超量表达苹果MdANR基因抑制了 DFR和CHI基因的表达，导致花青素合成的显著下降，同时单宁的单体一一儿茶素和表儿茶素的含量均显著增加[Han YP, etal.First published online January 20，2012]，这说明 MdANR 不仅能影响单宁合成途径上游基因表达，而且还可能同时催化儿茶素和表儿茶素两条合成途径。
[0003]抗广谱除草剂草丁膦的bar (bialaphos resistance gene)基因具有较好的抗除草剂抗性[(I)孟灵真等.新疆农业大学学报].2013，36(4):265-268 ； (2)De Block M, etal.EMBO J, 1987,6(9):2513-2518 ;杨竹平等，生物技术与可持续农业[Μ].上海:上海科学技术文献出版社，2000。]，既针对植物虫害和大量使用除草剂给植物所带来的负面影响，又可降低在农业生产中的人力和财力投入。bar基因也是常用的选择标记基因之一，将它与其它目的基因构建到同一载体上，选择培养基中加入一定的量就能筛选到含目的基因的转化细胞。它克服了抗生素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少。
[0004]绿色焚光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一类存在于水母、水媳和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发射绿色荧光[杨明瑜等，食品与生物技术学报，2008，3，27 (2)。]。作为基因选择，GFP在植物中主要有2个作用:监测基因的表达和蛋白质的定位；并且能作为转基因植物的分子标记，代替⑶ S 的作用[Jim H, Brad A.Technical Focus, 1995，8 (11): 10-11。]。GFP作为选择标记基因用来检测转基因效率，将其连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。作为转基因植株的报告分子GFP，最大的优点是，在不破环细胞和化学染色的情况下直接成像，检测极为方便[Chalfie M, et al.Science, 1994, (263):802-805。]。
[0005]目前，已报道从紫花苜蓿“中苜I号”幼果中克隆得到了一个ANR基因(BAN编码的ANR基因，S卩BAN基因)，构建了 MsANR基因的表达载体pCAMBIA1302_MsANR-GFP，将此表达载体通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因植株进行缩合单宁的含量检测，其含量明显高于对照植株。([I]王学敏等，中国草地学报.2012，(34)，2:8-15; [2]董洁，紫花苜蓿浓缩单宁合成途径中DFR和ANR基因的分离及遗传转化(博士论文，2012))。已构建的表达载体pCAMBIA1302-MsANR-GFP具有GFP标记基因，方便筛选转基因植株，其ANR基因来源于紫花苜蓿。红豆草缩合单宁含量远远高于紫花苜蓿，这可能与二者间ANR基因表达差异有关。目前，具有GFP标记基因及抗除草剂bar基因的缩合单宁合成酶BAN基因植物表达载体的构建策略未见相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体CPB-BAN-GFP。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体，所述植物表达载体为具有绿色荧光蛋白GFP标记基因和抗除草剂bar基因的缩合单宁合成酶BAN基因植物表达载体CPB-BAN-GFP。
[0008]本发明的第二个目的是提供了上述的用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体的构建方法，包括以下步骤:
[0009]I)红豆草花青素还原酶BAN基因的克隆:
[0010]选择甘肃红豆草叶片提取RNA并纯化RNA，反转录合成cDNA第一链，PCR扩增BAN基因；将回收的扩增产物连接到T载体转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序；将测序结果进行同源分析；确定缩合单宁合成酶BAN基因，得到重组子为:pMD-BAN ；
[0011]2)绿色荧光蛋白GFP基因的亚克隆:
[0012]挑取pBI 121-Lyz-GFP菌株的单菌落(pBI121-Lyz_GFP菌株的获得，可参见《pBI121-Lyz-GFP表达载体的构建及其在和田苜蓿愈伤组织中的转化》，柴燕文等，《农业技术生物学报》2008年05期)，摇菌、提取质粒，PCR扩增GFP基因，将回收的GFP目的片段与T载体连接后转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序，得到重组子为:pMD-GFP ；
[0013]3) CPB-BAN-GFP植物表达载体的构建及鉴定:
[0014]对pMD-GFP进行BamH I和Sma I双酶切，切下GFP基因；对pMD_BAN进行Sma I和Sac I双酶切，切下BAN基因；对载体CPB进行BamH I和Sac I双酶切，通过T4DNA连接酶将具有粘性末端的载体和基因，16°C过夜连接，连接产物转化感受态E.coli DH5 α，挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，得到CPB-BAN-GFP植物表达载体。
[0015]本发明的第三个目的是提供了获得一种转基因苜蓿的方法，是将上述的CPB-BAN-GFP植物表达载体通过农杆菌介导法导入苜蓿中，得到具有抗除草剂性质和缩合单宁含量高的转基因苜蓿。
[0016]进一步的，上述的获得一种转基因苜蓿的方法，是采用冻融法将植物表达载体CPB-BAN-GFP转化至根癌农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂布于含卡那霉素、利福平和链霉素的YEB固体培养基上，28°C恒温培养2d，挑取阳性单菌落，进行PCR鉴定。
[0017]进一步的，上述的获得一种转基因苜蓿的方法，将重组农杆菌转化紫花苜蓿的具体操作包括以下步骤:
[0018]A)种子消毒及培养条件:
[0019]挑选成熟饱满的种子，自来水室温浸泡4h，在超净工作台中用70%酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，再用0.1 %的升未浸泡lOmin，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干种子上的水分，接种到MS培养基中，于25°C培养7?1d左右；
[0020]B)受体材料的制备:
[0021]在高压灭菌过的培养皿中放入2?3张无菌滤纸，加适量YEB液体培养基使之湿润，将生长旺盛的紫花苜蓿下胚轴剪切成0.3?0.5cm的小段；
[0022]C)菌株的培养:
[0023]将保存的菌种用接种环挑取农杆菌单菌落用划线法接种于附加有50 μ g/mL Kan、25 μ g/mL StrJP 25 μ g/mL Rif的YEB固体培养基上，用paraf ilm膜将培养皿封口，并倒置于28°C恒温箱中培养2d，待菌落长出后置于4°C冰箱中保存，每半月继代一次；
[0024]D)菌液制备:
[0025]从保存农杆菌的抗性平板上选取分隔良好的单菌落用无菌牙签接种于5mL的YEB液体培养基(含 50