一种检测水体类金属砷的微生物学方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种检测水体中类金属砷的微生物学方法，具体涉及利用基因工程改造的大肠埃希氏菌报告菌株的构建方法，及建立其在检测水体环境中类金属砷的方法。【
背景技术：
】[0002]砷，是广泛分布于自然界的非金属元素。地壳中的含量约为2~5mg/kg，为构成地壳元素的20位。类金属砷是被国际癌症研宄署（IARC)归类为一级的人类致癌物。世界不同地区的21个国家受到了砷污染的影响，最大的风险群体来自孟加拉国，其次是印度的西孟加拉国，中国也是砷危害最重的国家之一。水体类金属砷污染已经在我国局部地区表现为公害病（如广东英德市横石塘镇龙新村岭下村组发生集体砷中毒事件、四川省凉山州西昌市安宁镇饮用水井砷污染事件、贵州省独山县瑞丰矿业公司违法排污造成砷污染事件、湖南省怀化市辰溪县一家硫酸厂违法排污造成村民砷中毒事件、广西河池市砷污染事件、河南省大沙河两起砷污染事件、苏鲁交界邳苍分洪道两起砷污染重大突发环境事件等）。因此，引起了人们的高度重视。在土壤、水、矿物、植物中都能检测出微量的砷。在正常人体组织中也含有微量的砷。[0003]随着科学技术的迅速发展，大量含砷化工厂建立，砷及其化合物被广泛应用于冶金以及各种除草剂、农药、化肥、杀菌剂的使用，在水体和土壤中的含量逐年增加，继而在一些植物或动物体内积累（如砷污染区的大米、贝壳类海鲜、动物肝肾脏等），并通过食物链在人体内蓄积，为目前已知的最易在体内蓄积的毒物之一。砷对人体毒性很大，对肾、肺、肝、生殖、脑、皮肤、呼吸、肠道及血液系统均可产生毒性，砷在体内的生化功能还未确定，但研宄提示砷可能在某些酶反应中起作用，以砷酸盐替代磷酸盐作为酶的激活剂，以亚砷酸盐的形式与巯基反应作为酶抑制剂，从而可明显影响某些酶的活性。有人观察到，在做血透析的患者其血砷含量减少，并可能与患者中枢神经系统紊乱、血管疾病有关。砷对环境的污染，主要是由工业废水排放引起（我国规定工业废水中砷的最高排放浓度为〇.Img·Γ1)。因此，对环境水体中类金属砷的检测显得尤为必要。[0004]目前监测和检测金属污染物主要有两种方法：（1)物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)气体氢化原子吸收光潜法（gaseoushydrideatomicabsorptionspectrometry，HGAAS)等，在文献BelkinS.Microbialwhole-cellsensingsystemsofenvironmentalpollutants.CurrentOpinioninMicrobiology2003Jun;6(3):206-12中。其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；而化学显色法、电化学法等，灵敏度、选择性不高，不易准确定量，特别是针对水体中生物有效性（bioavailability)重金属的检测，可选的特异、敏感、快速和便携的检测方法更少，难以对水体中重金属生物毒性效应进行客观评价。（2)基于生物有机体的微生物法，其一般分为基于质粒和基于基因组整合型两种。质粒整合型具有成本低、特异性强、快速、易操作等优点，但是基于质粒载体的生物检测菌株存在细菌传代后质粒拷贝数不均一（数量过高或丢失）而导致检测信号不稳定、荧光本底值高和独立实验重复性不好等缺陷。利用模式生物大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli)对特定化学物质分子反应的生物检测技术克服了如上不足，因此，建立一种特异、敏感、快速、廉价、稳定及精确的生物检测技术及其产品来评价环境中砷的生物毒性大小已经成为当务之急。在一系列新的检测方法中，生物监测方法，特别是利用微生物全细胞传感器来检测污染物已成为国际环境科学研宄的热点之〇[0005]生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研宄人员普遍亲睐。在过去的研宄中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的生物检测菌株及其产品，如：重金属、甲苯及其衍生物等。[0006]目前对砷在大肠埃希氏菌的具体耐受机制已有大量研宄，对砷离子测定的生物检测技术也有所研发，大肠埃希氏菌具有精细的调控系统使得细胞内砷离子保持在较低的水平，有研宄已发现大肠埃希氏菌中有两种负责编码将砷离子泵出基因，一种是存在于质粒上的arsA基因和arsB基因共同作用形成膜离子通道蛋白将砷泵出来维持细胞体内平衡，另一种是存在于基因组上的不含arsA基因而只含arsB基因形成膜离子通道蛋白将砷泵出来维持细胞体内平衡。查阅文献，研宄人员尝试在DH5a大肠埃希氏菌基础上构建检测砷离子的模式生物。但砷是一种常见的剧毒性环境污染类金属，大部分细菌对砷具有耐受性以及抗性，故其敏感性不高。且这些研宄是基于质粒作为表达载体，然而基于质粒载体的生物检测元件存在本底值高，细菌传代后质粒拷贝数不均一（数量过高或丢失），导致检测信号不稳定等缺陷。其作为检测砷的宿主菌会造成检测的不稳定和最低检测限偏高，这些非常不利于污染物的检测，必须采用新的方法提高生物学检测方法检测砷离子的敏感性，以有效解决当前环境监测工作中遇到的瓶颈问题。JudithStocker在DevelopmentofaSetofSimpleBacterialBiosensorsforQuantitativeandRapidMeasurementsofArseniteandArsenateinPotableWaterEnvironsciTechnol.20030ct15；37(20)：4743-50.中等构建的基于质粒上的大肠埃希氏菌生物传感器，其构建策略是将大肠埃希氏菌质粒上arsR启动子arsR基因与luxCDABE基因或荧光蛋白基因或萤火虫荧光素酶基因进行基因融合，再连接到pET28b质粒载体上。其能被砷诱导发光，且是在野生大肠埃希氏菌基础上构建检测砷离子的模式生物，存在荧光不稳定性、本低值高等缺陷。在专利《一种检测砷生物可利用度的微生物细胞传感器》CN102796693A中，大肠埃希氏菌E.coli作为宿主细胞承载重组质粒。重组质粒为含有砷抗性系统ars启动子、砷抗性系统调控基因arsR、焚光素酶基因Iuc和rrnb终止子串联序列的pUC18质粒。同样是基于质粒的微生物传感器，存在上述基于质粒作为表达载体的多种缺陷。重金属微生物检测技术的应用受到限制而发展缓慢。【
发明内容】[0007]本发明的目的：1.采用基因工程技术构建一株荧光本底值低、灵敏度高、特异性强、稳定、快速和成本低及定量检测水体中类金属砷浓度的大肠埃希氏菌生物检测菌株；2.建立一种检测水体中类金属砷的微生物学方法。【
发明内容】[0008]之一：提供一株检测水体中类金属砷的大肠埃希氏菌生物检测菌株。[0009]本发明的大肠埃希氏菌是：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli)WMC-OllpCGMCCNo.9760〇[0010]本发明的大肠埃希氏菌WMC-〇llp，已于2014年10月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌（E.coli)，保藏编号为CGMCCNo.9760。[0011]本发明所述生物检测菌株E.coliWMC-OllpCGMCCNo.9760的构建方法是：[0012]1.基因敲除野生型大肠埃希氏菌E.coliMC4100基因组中arsB基因[0013]采用Red重组系统，敲除野生型大肠埃希氏菌E.coliMC4100基因组中砷离子"外排泵"基因arsB(序列如SEQIDNO.1所示）；[0014]2.构建类金属砷检测元件pars-arsR_gfpmut2融合基因[0015]将大肠埃希氏菌基因组砷离子调苄基因arsR(序列如SEQIDNO.2所示）、启动子ars(序列如SEQIDNO.3所示）以及荧光报告基因gfpmut2(序列如SEQIDNO.4所示）通过通过交叉PCR技术，构建对类金属砷离子特异反应的检测元件：pars-arsR-gfpmut2融合基因；[0016]3.采用基因敲入技术构建检测类金属砷的大肠埃希氏菌生物检测菌株[0017]采用基因敲入技术将含有增强型绿色焚光蛋白报告基因pars-arsR_gfpmut2置换到E.coliAarsB菌株基因组中araB(序列如SEQIDNO.5所示）基因编码框位置。具体方法为：通过交叉PCR技术，形成含有pars-arsR-gfpmut2和araB基因两侧同源臂的融合片段，该DNA融合片段大小约为2.3kb，然后用无缝克隆的方法连接到pKOV条件复制质粒，构建pars-arsR-gfpmut2打祀载体，并将该打革E载体转化到E.coliAarsB菌株中，通过温度及蔗糖的选择，挑选成功发生两次同源重组的菌株，并进一步通过菌落PCR及测序鉴定筛选目的菌株。[0018]检测原理：[0019]本发明所述大肠埃希氏菌菌株定量检测水体中砷离子是采用pars启动子直接启动gfpmut2基因表达模式。在此构建中，当未添加外源性砷离子时，E.coliWMC-Ollp基因组中arsR基因编码产生的ArsR蛋白结合于pars启动子序列区，阻止GFPmut2表达；当外源性砷离子进入大肠埃希氏菌胞内后，As3+与ArsR蛋白结合，使ArsR蛋白从启动子上脱落，激活E.coliWMC-Ollp基因组中pars-arsR-gfpmut2融合基因的表达，从而产生GFPmut2蛋白，并且产生的GFPmut2蛋白的量或其荧光强度与砷离子浓度呈剂量依赖关系，所以通过测定荧光强度可以达到定量检测砷离子浓度的目的。【
发明内容】[0020]之二：提供一种检测水体中类金属砷的微生物学方法[0021]本发明所述大肠埃希氏菌菌株检测水体中类金属砷的微生物学方法流程为：[0022]1.环境水体样品测定的准备：[0023]取10-50ml待测环境水体样品，12OOOg离心5min，取上清，用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节上清样品的pH值为4-8,再用0.22微米的无菌针头滤器过滤，过滤后样品用于后续的测定。[0024]2.当前第1页1 2 3 4 5