一种水稻蛋白修复酶编码的基因的克隆及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种于水稻耐储性和 种子活力有关的蛋白修复酶（水稻OsPMTl)基因分离克隆、功能验证及应用。
[0002] 发明背景
[0003] 稻米在储藏时由于陈化变质和霉变等每年造成几十亿斤的损失，约占总储量的 3%，这不仅影响到国家粮食安全，也对食品安全造成很大的影响。同时，储藏过程中造成的 发芽率下降，对水稻育种工作造成的直接和间接经济损失更是不可估量的。选育到耐储存 的水稻优良品种对于提高国家粮食安全性和食品安全性是非常重要的。因此，利用现代分 子生物学手段挖掘新基因，提高水稻的耐储性和种子活力具有极大的现实意义
[0004] 蛋白质是生命的物质基础，它是细胞各种生命活动的直接参与者和执行者。生 物体生长发育各个阶段都伴随着多种蛋白质的合成、修饰、分解等变化，因此细胞内维持 蛋白质结构和功能的稳定，是保障细胞乃至机体正常生长发育所必须的，也是生物体对抗 生物和非生物胁迫，在多变的外界环境中幸存的一个重要因素。蛋白质在生物体内都会 发生自发的共价键反应，这些氨基酸的共价变化会引起肽链的构象发生改变，而这一过 程在胁迫条件下会加剧反应。这些共价损伤的积累是导致机体老化的一共重要原因，生 物体常常通过水解异构蛋白再重新合成来降低它们对细胞和组织的影响。尽管如此，一 些与老化相关的蛋白共价损伤能够通过另外的途径来修复。一般来说，共价损伤总是较 容易发生在极性氨基酸，如天冬氨酸（Aspartic acid, Asp),天冬酰胺，一些氨基酸的共 价损伤能够通过特殊的途径进行逆向修复。蛋白修复异天冬氨酸甲基转移酶（Protein Repair L-isoaspartyl Methyltransferase，PIMT)就能直接修复肽链上的异构天冬氨酸 (iso-Aspartic acid, isoAsp)与天冬酰胺，使得肽链能够恢复成正常的空间构象，重新激 活其生物活性。PMT广泛存在于生物体中，从细菌，植物到高等动物，包括人类。在细菌中和 线虫中，PIMT能够帮助老化组织对抗环境胁迫，如在高温胁迫中，提高存活率和延长寿命。
[0005] 在水稻中，没有关于PMT基因相关的报道，特别是国内对于植物PMT并没有任何 的文献资料，因此，PMT作为一个重要植物抗逆蛋白，它在水稻中的功能以及应用是值得关 注的。在植物领域的研究主要关注PIMT对于种子寿命和耐储性方面，这些研究可能是由于 PIMT的修复模式决定，由于其修复蛋白仅仅需要很少的能量和代价就能使变构蛋白活性恢 复，因此它在物质和能量有限，新陈代谢较为缓慢的阶段可能发挥更大的作用。以种子为 例，种子成熟后，含水量降低，种子内各种成分的含量和形态趋于稳定，当处于休眠后，新陈 代谢和细胞活动非常低，然而体内的生命活动没有停止，各种储藏蛋白质发挥着重要的功 能维持种子的正常运转以及对抗外界环境的变化。随着种子存储时间的延长以及外界环 境，如温度、湿度的变化，必然会引起种子内储藏蛋白的异构，进而导致蛋白失活。种子主要 依靠胚乳或子叶提供营养维持机体，随着体内储藏的营养不断的消耗，随之产生次生代谢 物和过氧化物必然会对种子造成损伤，进而使种子变质失活。因此，PMT对于种子内各种 蛋白结构的稳定性以及细胞功能的完整性应当具有一定的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的在于提供一种水稻OsPIMTl蛋白的编码基因。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述水稻OsPMTl蛋白。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述水稻OsPMTl蛋白的编码基因在制备转基因植 物中的应用。
【附图说明】
[0009] 图1日本晴PMTl基因全长CDS的获得。A.日本晴RNA电泳。B. OsPMTl的 3' RACE，M 为分子标记 DNAmarkerDL2000,1 为 OsPMTl 产物。C. OsPMTl 的 5' RACE，M 为 分子标记DNAmarkerDL2000。图2 4ZH T-DNA插入系结构图。R表示T-DNA右边界，L表示 T-DNA左边界，S表示正向引物，A表示反向引物。
[0010] 图 3 4ZH 的 PCR 检测。M 为 DNAmarker (DL2000)，ZHll 为中华 11，1-4 为 4ZH 植株。
[0011] 图4抑-?〇?(^42!1。]\1为0嫩11^『1?^(01^000)，2!111为中华11，42!1为42!11'-0嫩 插入株系。
[0012] 图5老化后ZHll和4ZH发芽率变化。*表示5 %显著性水平。
[0013] 图 6 OsPMTs 过表达和 RNAi 的 PCR 检测。M 为 DNA marker (DL2000)，P 为阳性质 粒，1为日本晴阴性对照，2-14为转基因植株。
[0014] 图7 OsPMTl过表达转基因植株的southern杂交检测。
[0015] 图8转基因植株的半定量RT-PCR分析。
[0016] 图9 OsPMTl转基因植株老化数据分析。
【具体实施方式】
[0017] 下文通过实施例对本发明做进一步说明
[0018] 实施例1
[0019] OsPMTl基因的克隆
[0020] 全长CDS的获得
[0021] 通过NCBI数据库，利用拟南芥和小麦的PMT基因编码区（coding sequence，CDS) 序列进行检索，获得高同源性的表达序列标签（expressed sequence tags, ESTs),通过序 列拼接cDNA序列。根据其保守序列设计引物利用Smarter RACE技术克隆出全长cDNA， 5' RACE和3' RACE引物如下：
[0022] MT1R5 :5' GTTCAACACCAACTGCTCGCCCTTCTG3'
[0023] MT1R3 :5' ATCGGTTACAACGCCACCATTTC3'
[0024] 首先提取粳稻日本晴的叶片和根的RNA (图1A)，通过SMARTer? RACE cDNAAmplification Kit反转录mRNA，分别制备用于含有特异性接头序列的5' RACE和 3' RACE的cDNA，反转录过程按厂商提供的说明书进行。将5'和3' RACE cDNA模版稀释50 倍作为RT-PCR模版，以5'RACE和3'RACE引物分别与试剂盒提供的通用引物UMP进行PCR 扩增（图1B、1C)，，将扩增产物连接到pJETl. 2克隆载体后送样测序。
[0025] OsPIMTl基因组序列的克隆
[0026] 通过NCBI数据库，利用已有的全长⑶S与水稻基因组进行比对，确定了 OsPMTl 的开放阅读框，并通过生物信息学软件预测其启动子区，设计了覆盖OsPMTl启动子区，外 显子区，内含子区和终止子区的引物序列，引物序列如下：
[0027] MT I g-F : 5 ' GAATTCAGCATCCTACCCCATCAAGACCTCGC3 '
[0028] MT I g-R : 5，AAGCTTCCTGATTTTGAGTCCTCCCGTCC3 '
[0029] 利用改良的CTAB法提取水稻叶片基因组DNA作为模版进行基因克隆，将扩增产物 连接到PJET1. 2克隆载体后送样测序，结果表明OsPMTl基因包含3个内含子，4个外显子。
[0030] 实施案例2
[0031] OsPMTl缺失体对于种子耐储性的影响
[0032] 通过RiceGE水稻突变体数据库搜索OsPMTl的突变体信息，发现一个OsPMTl的 T-DNA 插入突变体 04Z(图 2)，属于 Rice Mutant Database(RMD)，将在线 Tail-PCR 结果进 行Blast比对发现，插入位点可能位于OsPMTl第三个内