采用基因工程改造的耐热抗逆sod及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶及其编码基因与应用，特别涉及一种耐热超氧化物歧化酶及其编码 基因与其在耐热冲氧化物歧化酶。
【背景技术】
[0002] 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase.简称S0D)是美国科学家Mccord和 Fridovichl969从牛血红细胞中发现的一种含有金属离子的酶。该酶能专一的清除生物氧 化过程中产生的超氧阴离子自由基，是机体对抗自由基的第一道防线，在维护生物机体内 自由基产生与清除的动态平衡过程中起着极其重要的作用。基于结合金属辅基的不同，可 以将SOD分为四大类：Cu/Zn-S0D、Mn_S0D、Fe-S0D和Ni-SOD。SOD具有抗炎，抗辐射，抗肿 瘤，抗衰老等作用，并用于病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和再灌流综合症、老年 性白内障、心血管疾病、辐射病和癌症的临床治疗；在食品工业中可添加作为保健食品的功 效因子；在化妆品中可添加用于防晒、抗氧化及防止皮肤衰老、防止瘢痕形成等。
[0003] 由于SOD的营养和保健功能，国内市场上已经出现了许多SOD产品，如含有SOD 的啤酒，水果，大米，口服液等等，产品加工中大多涉及加热、有机提取等步骤，常温SOD在 此过程有半衰期短，遇高温、变性剂、有机溶剂易失活等不利因素。这不仅使含SOD的产品 开发增加了困难，限制了产品的加工工艺，而且使含SOD的产品有效期大大缩短，迫使产品 的存储、运输销售周期变短，增大了经营困难。因此对天然SOD进行修饰改造，增加其对高 温、酸碱、有机溶剂、变性剂和抑制剂等的抗逆性就显得十分必要。目前对SOD的改造方法 主要有基因工程方法、化学修饰、酶固定化以及研宄SOD模拟物。
[0004] 本发明涉及一种基因工程改造的耐热抗逆SOD及其编码基因。MOD是来自严格 需氧极端嗜热古生菌的一种天然嗜热S0D,具有潜在的工业应用 价值。利用基因工程在其N端添加一段氨基酸序列，重组表达得到一种具有更强的耐高温、 酸碱、清洁剂、蛋白抑制剂和变性剂的高稳定性S0D，有利于在保健食品、化妆品、啤酒饮料 等产品中的应用，是理想的生化功能添加剂，具有广阔市场和应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种新的、耐高温的超氧化物歧化酶及其编码基因。
[0006] 本发明的超氧化物歧化酶S0D，名称为rMOD，是具有下述氨基酸残基序列之一 的蛋白质： 1) 序列表中的SEQ ID NO. 1; 2) 将序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸的取代、缺失或添 加且具有平衡机体内氧自由基作用的蛋白质。
[0007] 序列表中的SEQ ID NO. 1由455个氨基酸残基组成。455个氨基酸残基如下：MDD QTLFAQYAAEVNEWGEQVKQVLELRGASIDGASTLLQFIAEHDGKWTEEAVRELTRLVDDVYAAALRHYAIEAAEffG KQVEHALSMRGAAEDIGLSSLLARIEEHGDEWTEEEIHELQLLVDDVYARAIRLVEPLSDGQEEDLTRQEEVSALPE QEGGNREQMSKGTERSGEHKGDSEQEPVVAAERAEPFIASSTDSPDGEQLHE⑶TMDEEWRHNADMTDKERLPEEGV TDGERQRAVSMTLQIQFKKYELPPLPYKIDALEPYISKDIIDVHYNGHHKGYVNGANSLLERLEKVVKGDLQTGQYD IQGIIRGLTFNINGHKLHALYWENMAPSGKGGGKPGGALADLINKQYGSFDRFKQVFTETANSLPGTGWAVLYYDTE SGNLQIMTFENHFQNHIAEIPIILILDEFEHAYYLQYKNKRADYVNAWWNVVNWDAAEKKLQKYLTK 上述耐热超氧化物歧化酶的编码基因是具有下述核苷酸序列之一： 1) 序列表中SEQ ID NO. 2的DNA序列； 2) 编码序列中SEQ ID NO. 1蛋白质序列的多核苷酸； 序列表中的SEQ ID NO. 2由1368个碱基组成，其编码序列为自5'端第1到第1268位 碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸残基序列的蛋白质。
[0008] ATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCCAGTATGCGGCTGAAGTGAACGAATGGGGAGAACAAGTCAAGCAG GTGCTGGAACTGCGCGGGGCAAGCATTGATGGCGCTTCTACACTGTTGCAGTTTATCGCCGAACATGACGGGAAGTG GACGGAAGAGGCAGTCCGTGAGCTCACGCGCCTTGTTGATGACGTGTACGCTGCTGCGCTTCGTCACTATGCCATCG AAGCGGCTGAGTGGGGGAAACAAGTAGAACACGCTCTATCCATGCGCGGAGCAGCGGAGGACATCGGGCTTTCTTCT TTATTGGCGCGCATTGAAGAACACGGCGACGAGTGGACGGAGGAAGAAATTCATGAACTGCAACTCCTTGTCGACGA CGTGTACGCTCGAGCCATCCGCCTTGTCGAACCGCTATCCGACGGGCAGGAGGAAGACTTGACGCGGCAGGAAGAAG TCTCGGCTTTGCCTGAACAGGAGGGCGGCAACAGAGAGCAAATGAGCAAGGGAACTGAACGGTCAGGCGAACACAAG GGGGATAGCGAACAAGAGCCGGTCGTTGCAGCTGAACGGGCGGAGCCGTTCATAGCCTCATCAACGGATTCTCCTGA TGGCGAACAGCTGCATGAGGGAGATACGATGGACGAAGAATGGCGGCACAATGCAGACATGACAGATAAGGAGCGGC TGCCGGAGGAAGGTGTGACCGATGGTGAGCGGCAACGGGCGGTTTCGATGACTCTCCAAATTCAGTTTAAAAAGTAC GAGCTACCTCCATTACCCTACAAGATAGATGCATTAGAACCGTATATAAGTAAAGATATAATTGATGTACATTATAA CGGACATCATAAAGGCTATGTAAATGGAGCAAATTCACTCCTAGAAAGACTAGAAAAAGTAGTAAAAGGAGATTTAC AAACAGGGCAATATGATATTCAAGGTATTATACGTGGTCTTACGTTTAACATTAATGGACACAAGTTACACGCCTTG TATTGGGAAAATATGGCACCAAGTGGAAAAGGTGGTGGAAAACCTGGTGGTGCACTAGCAGACTTAATAAACAAGCA ATATGGTAGTTTTGATAGGTTTAAGCAAGTATTTACTGAAACTGCTAATTCACTACCCGGGACTGGTTGGGCTGTTC TCTATTACGATACTGAGTCTGGCAATTTGCAAATTATGACGTTCGAAAATCACTTCCAAAATCATATAGCGGAAATA CCAATAATATTAATACTAGATGAGTTCGAGCATGCGTACTATCTTCAGTATAAGAACAAGAGAGCTGATTACGTTAA TGCTTGGTGGAATGTAGTAAATTGGGATGCAGCGGAAAAGAAGTTACAGAAATATTTAACGAAGTAA 含有本发明的表达载体及宿主菌均属于本发明的保护范围。
[0009] 扩增冲任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种表达上述耐热超氧化物歧化酶的方法。
[0011] 本发明所提供的表达上述耐热超氧化物歧化酶的方法，是构建含有耐热超氧化物 歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使耐热 超氧化物歧化酶基因表达。
[0012] 所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为 大肠杆菌。
[0013] 所述大肠杆菌可为万· BL21 (DE3)。
[0014] 用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达 载体，优选为可表达His6-Tag结构的pET-28a ( + )。
[0015] 用于基因工程改造的N端基因序列（Ν-/\&5·〇〇0来源于 (GTNG_2215)的 N 端 l_732bp 喊基。提取(JeoAaciBw1SiAerffioofe /7iiri/ic<msNG80-2 基因组为模板，以引物序列 5' CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC 和5' TTTGGAGAGTCAT CGAAACCGCCCGT扩增序列Ν-τ々7·5〇?/;天然嗜热MOD基因序列 来源于Yamano et al，J Biochem 125:186-193 (1999)，并由金唯智生物科技(北京）有限 公司合成并克隆到载体pET-28a ( + )。以含ASOD