作为毒蕈碱受体m1亚型调节剂的多肽及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对毒蕈碱受体Ml亚型具有调节活性的新的多肽。本发明也涉及所述 多肽在治疗由毒蕈碱受体Ml亚型介导的疾病，尤其是青光眼治疗时并发白内障、慢性阻塞 性肺炎、消化性溃疡及阿尔兹海默病中的用途。另外，本发明涉及所述多肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 胆碱受体一般与内源性神经传导递质乙酰胆碱（ACh)结合，因而激活细胞下游信 号转导通路，产生生物活性。哺乳动物外周及中枢神经系统中的胆碱受体依照毒蕈碱和烟 碱的激动剂活性，可以分为毒蕈碱受体（mAChR)和烟碱受体（nAChR)。其中，mAChR按药理 学分型可分为Ml，M2, M3, M4四种亚型；按分子生物学分型可分为ml，m2, m3, m4, m5五种亚 型。M受体通过与不同的G蛋白结合，在全身各部位引起不同的生理生化效应，起作用的不 同可能与其存在多种亚型和分布部位的不同有关。
[0003] Ml受体在全身分布较广，而以眼、气道、心脏、胃肠道和中枢分布较多，其在这些部 位介导了一些重要的生理作用。在临床应用中，Ml受体阻断剂可减少抗胆碱酯酶药用于青 光眼治疗时白内障的发生，还可使肺通气功能得到改善，并可减少胃酸分泌，如联合其他药 物则用于消化性溃疡的治疗；Ml受体激动剂则可改善阿尔茨海默病人的学习记忆功能并 延缓其病情的发展。选择性作用于Ml受体的药物在临床应用中是很有价值的。
[0004] 目前的Ml受体活性调节剂基本上都是小分子化合物，其中包括像包公藤甲素、马 钱子碱等天然产物，也包括氧化震颤素、AC-42等合成化合物。但多数调节剂对Ml受体的 选择性不高，容易作用于其他非靶组织，产生毒副作用。因此，新型选择性Ml受体调节剂的 研宄势在必行，提高Ml受体调节剂的选择性有助于在通过调节Ml受体活性治疗相关疾病 时，减少甚至消除诸如口腔干燥、便秘等副作用。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种作为选择性Ml受体调节 剂的多肽及其制备方法和用途。
[0006] 本发明人根据能选择性调节Ml受体活性的多肽毒素 MT7的特殊三维结构，利用计 算机同源模建的方法，构建了 Ml受体的三维立体结构模型。基于MT7毒素与Ml受体之间 的特异性结合，综合运用蛋白质-蛋白质对接、分子动力学模拟、结合自由能计算、氨基酸 残基能量分解、简正振动分析等分子模拟方法，对MT7毒素与Ml受体之间的相互作用模型 进行了全面解析。
[0007] 本发明人继续以Ml受体为靶点，基于MT7毒素与Ml受体的特异性相互作用模型， 应用上述分子模拟方法，结合多肽合成、放射配基结合活性检测、细胞钙流激活实验检测方 法，经合理药物设计、合成并筛选出一系列能调节Ml受体活性的多肽。具体是基于此前的 结合自由能计算及能量分解分析，确定MT7毒素中与Ml受体存在相互作用的关键残基，结 合MT7毒素的三维结构，设计出具有特定三维结构及表面电荷特性的多肽序列，利用这些 多肽开展其与Ml受体的结合活性研宄及对Ml受体的调节活性研宄，实验结果表明，这些多 肽能有效地与Ml受体结合并对其活性进行调节，对毒蕈碱受体Ml亚型介导的病症、特别是 青光眼治疗时并发白内障、慢性阻塞性肺炎、消化性溃疡及阿尔兹海默病具有潜在的治疗 价值，由此得以完成本发明。
[0008] 本发明提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者所述多肽 是氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 获得的且具有毒蕈碱受体Ml亚型调节活性的多肽。
[0009] 本发明的多肽能有效地与Ml受体结合并对其活性进行调节，对毒蕈碱受体Ml亚 型介导的病症、特别是青光眼治疗时并发白内障、慢性阻塞性肺炎、消化性溃疡及阿尔兹海 默病具有潜在的治疗价值。
[0010] 较佳地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1~16所示。
[0011] 本发明还提供一种编码权利要求1或2所述的多肽的核酸。
[0012] 较佳地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17~32所示。
[0013] 本发明还提供一种含有上述核酸的重组载体。
[0014] 本发明还提供一种用上述重组载体转化或转染的宿主细胞。
[0015] 本发明还提供一种上述多肽的制备方法，包括用上述宿主细胞表达上述多肽，然 后分离上述多肽。
[0016] 本发明还提供一种药物组合物，其包括上述多肽、以及药学上可接受的辅料或载 体。
[0017] 所述药物组合物中，所述多肽为第一活性成分，所述药物组合物还包括胆碱酯酶 抑制药、支气管扩张药、胃酸分泌抑制药和促智药中的至少一种作为第二活性成分。
[0018] 优选地，所述药物组合物包括上述多肽、以及与所述多肽相缀合或混合且能保持 所述多肽活性稳定的制剂。
[0019] 较佳地，所述制剂是纳米材料、脂质体或油性化合物。
[0020] 本发明还提供一种上述多肽在制备治疗毒蕈碱受体Ml亚型介导的病症的药物中 的用途。
[0021] 较佳地，所述病症是青光眼治疗时并发白内障、慢性阻塞性肺炎、消化性溃疡及阿 尔兹海默病。
【附图说明】
[0022] 图 I SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 4 及 SEQ ID NO. 5 多肽与 Ml 受体的 放射配基实验结果； 图2 SEQ ID NO. 3-5多肽对卡巴胆碱刺激Ml受体高表达细胞释放钙流信号的调控结 果； 图3 SEQ ID NO. 6-8多肽对卡巴胆碱刺激Ml受体高表达细胞释放钙流信号的调控结 果。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式 仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0024] 本发明的能调节毒蕈碱受体Ml亚型活性的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所 示，其中两个半胱氨酸之间存在二硫键。另外，本发明的多肽也可以是其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加所得，其中两个半胱氨 酸之间存在二硫键，精氨酸为必需保守氨基酸，所述多肽例如如SEQ ID NO. 2~16所示。
[0025] 本发明的多肽中，序列中的两个Cys氨基酸间均形成二硫键，约束模拟肽拓扑结 构为环形肽，使得模拟肽能保持稳定的β折叠结构，该结构是模拟肽与Ml受体相互作用的 核心部分；形成二硫键的Cys氨基酸外侧可分别保留0-2个氨基酸，其内侧可以保留3-18 个氨基酸，取决于所形成β折叠结构的长度；同时，在两个Cys氨基酸之间的中间位置应由 Pro-Arg组成，这两个氨基酸是识别Ml受体的关键残基，是ΜΤ7模拟肽的必要组成部分。
[0026] 本发明的多肽可以通过如下方法获得。
[0027] 根据能选择性调节Ml受体活性的多肽毒素 ΜΤ7的特殊三维结构，利用计算机同源 模建的方法，以β肾上腺素的晶体结构为模板，构建了 Ml受体的三维立体结构模型。基于 ΜΤ7毒素与Ml受体之间的特异性结合，综合运用蛋白质-蛋白质对接、分子动力学模拟、结 合自由能计算、氨基酸残基能量分解、简正振动分析等分子模拟方法，对ΜΤ7毒素与Ml受体 之间的相互作用模型进行了全面解析。然后，以Ml受体