一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种基于树状分子的pH响应型脂质及 其制备方法与应用。 技术背景
[0002] 越来越多与基因相关的疾病被认为是可以利用基因治疗的方法治愈，这些疗法通 常需要将核酸药物递送到靶细胞，从而对一些肿瘤、哮喘和心血管疾病进行治疗。但是迄今 为止，限制基因药物投放临床试验的瓶颈一直是安全有效的载体的研发。鉴于病毒载体的 高免疫原性，非病毒载体成为了研宄的热门。然而非病毒载体往往难以获得很高的体内外 转染效率，为了提高非病毒载体的转染能力，就需要让非病毒载体获得如病毒一样的对复 杂的机体环境进行响应的能力。然而，目前能够很好地模拟病毒载体，能够对复杂的机体环 境进行响应的非病毒载体的研宄还处在初步研宄阶段，相应的载体材料还有待进一步的开 发。
【发明内容】
[0003] 研宄表明，肿瘤环境与正常组织环境是有着一定差异的，例如pH、氧化还原物质浓 度、酶的种类与数量、温度等。所以现在人们利用这种差异设计出多种单一响应式的载体系 统，比如酶响应、温度响应、pH响应或还原响应等。
[0004] 研宄证明，正常组织中其体液pH为7. 4即正常生理环境，而在肿瘤组织中由于肿 瘤组织的供氧不足而产生乳酸和三磷酸腺苷（ATP)水解的产物，导致肿瘤组织pH值降低至 6. 8。继而载体颗粒进入细胞形成内涵体，随着细胞质中的氢离子被泵入使得纳米粒所在微 环境的PH值进一步降低（〈5.5)。普通的基因载体在这种转染环境中会无法避免DNA在酸 性条件下发生降解，降低了转染效率。而利用这种转染过程中所遇到的阶梯式PH下降所设 计的多重刺激响应型的病毒载体，可以智能化的增加细胞对基因的吞噬能力和从溶酶体的 逃逸能力，大大加强了基因到达肿瘤细胞核的概率。
[0005] 现在最常用的阳离子脂质载体中通常都含有各种阳离子磷脂成分，如D0GS、D0SPA 等。这些磷脂成分在释放DNA后，由于降解缓慢会极大的地损伤细胞器而造成很高的细胞 毒性。此外，过高的正电荷也会因吸附过多的非特异性血浆蛋白而导致转染效率在有血清 条件下或在体内条件下急剧下降。将机体自有的氨基酸和易降解的酰胺键加入脂质中增 加了载体的生物降解性，而制备出的表面电荷为负的脂质体也有效降低了传统脂质体的毒 性。
[0006] 基于上述研宄分析，本发明提供了一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备 方法及其在基因载体或药物载体中的应用，采用本发明所述的PH响应型脂质材料制备的 基因载体或药物载体能够利用输送过程中体内微环境中的PH差异，达到有效快速传递基 因或药物的效果。
[0007] 本发明通过以下技术方案来实现：
[0008] -种基于树状分子的pH响应型脂质材料，所述脂质材料的主体为外围含氨基和 \或胍基的树状分子，所述树状分子的一端连接有疏水基团，另一端连接有多个具有PH响 应功能的亲水性基团，所述具有PH响应功能的亲水性基团为与所述树状分子末端的氨基 或胍基相连的A类基团或B类基团中的至少一种，其中A类基团在环境pH为6. 8以下时能 够断裂脱落，B类基团在环境pH为5. 5以下时能够断裂脱落。
[0009] 在上述pH响应型脂质材料中同时含有疏水基团和亲水性基团为两亲性分子，有 利于形成自组装体便于在应用中对药物或基因等进行包裹。所述的A类基团或B类基团具 有负电性，对树状分子外围的氨基和\或胍基的正电荷具有屏蔽作用，使所述脂质材料整 体带负电荷，能够形成具有较高负电荷的自组装体，可与不同的药物或阳离子基因载体、基 因一起组成负电性的、中性的或微正电的具有pH响应能力的复合物，该复合物可以在肿瘤 组织外正常pH环境下保持稳定，不会与体内负电性物质发生聚合，同时还可以保护DNA不 被血清中的脱氧核糖核酸酶（DNase)降解，从而可以在体内进行长时间循环。同时，所述A 类基团或B类基团具有pH敏感特性，能够在一定的酸性条件下断裂脱落，当环境pH在6. 8 以下时（如肿瘤组织处），A类基团断裂脱落，使得三元复合物发生电荷翻转或者正电荷增 多，利于与负电的细胞膜发生吸附作用，从而更好地被细胞内吞，增强了载体入胞能力。而 内吞入胞后，当环境PH在5. 5以下时（所形成的细胞溶酶体的微环境），B类基团发生断 裂，暴露更多的氨基，使得质子缓冲能力和破坏溶酶体膜的能力增加，达到加速从溶酶体中 逃逸的效果。采用PH响应机制，使得载体具有类似病毒随着环境的变化而完成入胞、逃逸 等过程，可以提高基因运输的效率，并远优于非响应性基因载体。
[0010] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述A类基团为
二 ΛΛ 甲基马来酸酐基团），B类基团为
戶的至少一种。
[0011] 作为可选方式，在上述PH响应型脂质材料中，具有pH响应功能的亲水性基团只含 有A类基团。所述脂质材料具有一重pH响应特性。当此类组装体进入体内，同样具有屏蔽 体内负电性物质干扰和保护DNA的作用。只含有能够在pH 6. 8断裂的pH敏感型基团的复 合物在进入肿瘤组织后发生电荷翻转或者正电荷增多，获得更强的入胞能力，从而有利于 药物或基因的传递。
[0012] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，具有pH响应功能的亲水性基团只含 有B类基团。所述脂质材料具有一重pH响应特性。当此类组装体进入体内，同样具有屏蔽 体内负电性物质干扰和保护DNA的作用。只含有能够在pH 5. 5断裂的pH敏感型基团的复 合物在进入细胞后，才发生电荷翻转或者正电荷增多，增强传递系统破坏溶酶体膜的能力， 阻碍了溶酶体酶对DNA的降解，从而实现基因的高表达或药物的有效释放。
[0013] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，单个脂质分子结构中同时含有A类 基团和B类基团，所述脂质材料具有多重pH响应特性。
[0014] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述脂质材料为只含A类基团的脂 质与只含B类基团的脂质的混合物，所述脂质材料具有多重pH响应特性。进一步的，所述 脂质材料是由两种类型的PH响应型脂质（分别含A类基团和B类基团）按不同同比例混 合后制备成混合自组装体。所述自组装体的制备可采用溶剂注入法或薄膜超声法等常用的 自组装体制备方法（具体方法可参见《现代药物制剂技术丛书--脂质体技术》，邓杰英主 编，人民卫生出版社2007年出版）。
[0015] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述pH响应型脂质分子结构中50% 以上的氨基上修饰PH响应型基团。足够高的接枝率才有利于保证所述脂质材料具有较高 的电负性。
[0016] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述疏水基团为饱和或不饱和烃基 或胆固醇衍生物。本发明中的烃基是指含碳、氢两种原子的官能团，可以看作是相应的烃失 去一个氢原子（H)后剩下的自由基。优选为烷基、烯基，芳香基、更优选为C10-C20的烷基、 C10-C20的烯基、含有芳香基的氨基酸衍生物。
[0017] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，可以选择具有多官能度的分子作为 桥接单元来将疏水基团连接到树状分子的一端，可选用肽键连接，也可选用其他的连接方 式代替肽键连接，也可以不使用桥接单元而将疏水基团直接连接到树状分子的一端。总之， 以使树状分子的一端局部疏水性为目的，具体的连接方式可灵活选择。
[0018] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述疏水基团依靠谷氨酸通过肽键 连接到树状分子的一端。谷氨酸中的氨基可与树状分子中的羧基缩合形成肽键，而谷氨酸 另一端的两个羧基可分别连接疏水基团，从而使所述脂质材料具有两条疏水链，更有利于 实现自组装。该可选方式旨在提供一种在树状分子的一端连接疏水基团的具体示例，本领 域技术人员在本发明的总体构思下，可以选择其他具有多官能度的分子作为桥接单元来将 疏水基团连接到树状分子的一端，可选用具有2个相同氨基或者羧基的氨基酸（如谷氨酸、 天冬氨酸、赖氨酸、鸟氨酸），也可选用其他的连接方式代替肽键连接，也可以不使用桥接单 元而将疏水基团直接连接到树状分子的一端。总之，以使树状分子的一端局部疏水性为目 的，具体的连接方式可灵活选择。
[0019] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述树状分子为球形树状分子或扇 形树状分子，优选扇形树状分子。采用扇形树状分子时，在其核心接枝疏水基团即可，在接 枝较短的疏水链段的情况下就容易获得较好的自组装特性。
[0020] 作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述树状分子为二代以上的肽类树 状分子，其重复单元为官能度大于等于3的氨基酸。更高代数的树状分子有利于提供更多 的官能团，有利于接枝更多的具有pH响应功能的亲水性基团，有利于提高材料的pH响应能 力和电负性。进一步的，所述树状分子的重复单元为赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的至少一 种，采用这类氨基酸作为重复单元，所得的树状分子外围本身就具备大量的氨基或胍基，无 需进行进一步的接枝改性，可直接与具有PH响应功能的亲水性基团连接。
[0021] 作为可选方式，所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料的结构式如下：
[0023] 其中，K为树状分子的重复单元（不同代数间的重复单元可以相同也可以不同）， Gl和Gn分别表示一代和η代树状分子，η为2或3或4或5, Rl为具有pH响应功能的亲水 性基团，R2为疏水基团。
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