测序方法
【专利说明】测序方法
[0001] 本发明涉及用于确定多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法，所述多核苷酸例如 来源于天然存在的DNA或RNA。
[0002] 由于测序的单位成本下降并且越来越快的测序机器进入市场，遗传物质的下一代 测序已经对生物科学整体并且特别是对医学产生了显著的影响。例如，我们同时待审的 申请WO 2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中特别是单链或双链多核苷酸样品 (例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其转运通过纳米孔 基底而被读取，所述纳米孔基底设置有在纳米孔的出口内或附近并置的等离子体纳米结构 (plasmonic nanostructures)。在这种装置中，所述等离子体纳米结构限定检测窗（基本 上是电磁场），在其中每个核苷酸碱基（任选被标记的）又通过与入射光相互作用以特有方 式被诱导产生荧光或拉曼散射质子。然后，在远端、多路检测这样产生的质子，并转换成数 据流，其信息内容表征与所述多核苷酸相关的核苷酸碱基序列。然后，利用编程到与其集成 在一起或在与其相连的辅助计算装置中的微处理器中的相应软件实施的计算算法，可以从 所述数据流恢复所述序列。
[0003] 用于快速测序多核苷酸的另一种装置例如记述在US 6627067, US 6267872和US 6746594中。以其最简单的形式，所述装置利用电极，而不是等离子体纳米结构，来定义穿过 基底或在纳米孔中或周围的检测窗。然后，电势差穿过电极施加，并且作为时间的函数检测 其间流动的离子介质的电特性的变化，所述变化由多核苷酸和结合的电解质通过纳米孔电 泳转运所致。在所述装置中，由于多个个体核苷酸碱基通过所述检测窗，它们连续地阻塞和 开启所述检测窗，引起'阻塞事件'，这产生电流或流阻率的特征性波动。然后，利用这些波 动来产生适当的数据流，用于上文所述的分析。
[0004] 稳定的小滴流（droplet stream)，尤其是微滴流（microdroplet stream)的产 生，是已经用于分子生物学的另一个技术发展领域。例如，US7708949公开了一种用于在 油中产生稳定的水滴的新型微流体方法，而例如US2011/0250597描述利用这一技术来产 生微滴，所述微滴含有核酸模板（典型地是多核苷酸DNA或RNA片段）和多个引物对，其 允许利用聚合酶链式反应扩增所述模板。涉及这种方法和这一领域的其他专利申请通 常包括 US 2010/184020, US2012/0164633, US2012/0122714, US2011/0000560, US2010/01 376163, US2010/0022414 和 US2008/0003142。J. Molecular Diagnostics (分子诊断杂 志)14 (3) 233-246 (2012)记述了该微滴PCR法在鉴定与先天性肌营养不良症（congenital muscular dystrophy)相关的基因突变中的应用。
[0005] W02007/120240 和 J. Anal. Chem.(分析化学杂志）盤 8439-8447 (2011)分别描述 了表征核酸的基于小滴的方法，其涉及焦磷酸测序。
[0006] 类似地，在分析分子生物学中广泛应用典型地包含少于1000个核苷酸长的已知 序列顺序的单链寡核苷酸的生物探针。当探针与靶标的核苷酸碱基之间存在充分的序列互 补性时，此类探针典型地通过将其本身与靶标（例如，来源于天然存在的病原体的DNA的靶 标）连接而起作用。典型地，所述探针的核苷酸用可检测元件如放射性或荧光标记物进行 标记，以致当将探针用于处理据信其中或其上已经捕获有靶标的分析物溶液或基底时，通 过寻找和检测所述检测元件的特征性检测特性来显示所述靶标的存在或不存在。
[0007] -类这样的探针由在本领域中被称为'分子指示标（molecular beacons) '的物质 所代表，例如，如在W002/06531或US8211644中所述的。这些探针由单链寡核苷酸组成，所 述单链寡核苷酸实际上已经向回折叠于其自身上从而产生充当探针的传感器的剩余的单 链环和短茎，在所述茎中，邻近两个末端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；由此 产生双链区域。这种布置是高度紧张的，所述布置可以连接到发夹上，其中单链环连接到名 义上双链的寡核苷酸的同一末端的互补链。所述寡核苷酸的游离的3'和5'端（现在彼此 邻近并且在茎的远端）分别连接荧光团和猝灭剂。然后其几何学上的彼此接近确保不产生 显著的荧光。使用时，靶标与单链环结合，产生另外的应变，以致当加热所述探针时引起茎 解链，这使所述荧光团和猝灭剂远离，并且允许前者发出荧光。
[0008] 我们现在已经开发了确定多核苷酸样品中的核苷酸碱基的序列的新方法，该方法 不同于上述那些方法，并且其中来源于样品的在流中的包含个体单核苷酸的小滴（其顺序 对应于样品的核苷酸碱基对序列）在用特定的标记的生物探针处理后被查询。典型地，该 处理的结果是在每个小滴中产生与其中的核苷酸相关联的特定核苷酸碱基所特有的一个 或多个可检测元件。该方法的一个特征是使用新的生物探针，其中可检测元件基本上是不 可检测的，除非被一系列生化/酶反应特异性激活，所述生化/酶反应从所述探针释放处于 可检测状态的所述可检测元件中的一个或级联。
[0009]因此，根据本发明，提供一种用于确定多核苷酸分析物中的核苷酸碱基的序列的 方法，所述方法特征在于下述步骤：
[0010] a.产生小滴流，所述小滴中的至少一些包含单核苷酸，并且其中在所述小滴流中 单核苷酸的顺序对应于所述分析物中核苷酸的序列；
[0011] b.向每个小滴引入多个生物探针类型，每个类型（i)包含处于不可检测状态的不 同的可检测元件，并且（ii)适于捕获组成所述分析物的不同的互补的单核苷酸；
[0012] c.使包含在所述小滴中的单核苷酸与其互补的探针结合，以产生占用的探针；并 且
[0013] d.使所述可检测元件以可检测的状态从占用的探针释放。
[0014]在本发明的一个优选的实施方案中，每种生物探针包含单链核苷酸区，其末端连 接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特 性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区上，以致所述可 检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单核苷酸时低。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针本身在用 于检测荧光团的那些波长基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可能在电磁谱的大部分上表 现出普遍的、低水平的背景荧光，但是典型地存在其中荧光强度处于最大值的一个或少量 的特定波长或波长范围（wavelength envelopes)。在特征性检测所述焚光团的这些最大值 中的一个或多个，基本上应当不产生荧光。在本发明的情形中，术语'基本上不发荧光'或 等价的词语意指连接到探针的全部荧光团在相关特征性波长或波长范围的荧光强度不到 等量的游离荧光团的相应的荧光强度的25% ;优选不到10% ;更优选不到1%，并且最优选 不到0. 1%。
[0016] 原则上，可以使用任何方法确保在探针的未使用状态，所述荧光团基本上