在用于蛋白质表达的细胞系中减少酰胺化的氨基酸形成的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种在细胞系的蛋白质表达过程中减少酰胺化的氨基酸的形成的方 法、细胞系及相关应用。
【背景技术】
[0002] 虽然蛋白质主要是以其氨基酸序列（原始结构）来表征，但是，在其他方面，像众 多的翻译后修饰等也对蛋白质的特征产生影响，如影响蛋白质的二级、三级或四级结构等。 其中的一些翻译后修饰对新产生的蛋白的活性具有重要的影响，包括对生物制药生产的药 物的安全性和功效产生影响等。
[0003] -种对蛋白质的异质性具有重要影响的因素是包括酸性变种在内的电荷模式 (chargepattern)。这种电荷模式的形成的方式可以是，例如，像天冬酰胺等氨基酸的脱酰 胺，糖基化或者通过N-末端谷氨酰胺形成焦谷氨酸，以及一些基本的变种，例如，酰胺化的 氨基酸，特别是C-末端脯氨酸酰胺残基等。
[0004] 酰胺化的氨基酸的形成，如C-末端脯氨酸酰胺，却是在某些情况下不愿看到，例 如，当形成的酰胺化的氨基酸作为一种不受欢迎的异质性来源，或者氨基酸变异可能导致 蛋白质的活性或免疫原性受影响，或者酰胺化的氨基酸的含量，例如脯氨酸酰胺的含量，在 产生的蛋白质中比在参考蛋白中更高或更低。
[0005] 相比较能够在高度可控的物理化学条件下产生的小分子药物，蛋白质尤其是作为 生物治疗性质（生物制药）的蛋白质，因生产过程中使用的是活细胞培养系统，从而整个生 产过程是高度复杂且难以控制的。因此，发展一种简便的、能够用于特别控制产生的蛋白质 的翻译后修饰的工具箱是尤为重要的。通过该工具箱可以得到一种具有恒定的产品质量和 恒定的高产量的蛋白质产品，并可以提高生产过程的效率，增加和/或微调生产的蛋白的 生理活性及衍生出的药物的生物安全性，和/或使生产出的蛋白质的翻译后修饰的特性与 参考蛋白匹配。
[0006] 本发明的目的正是提供系统和方法以解决上述问题及需求。
[0007] 本发明的独立权利要求记载的系统和方法能够解决上述问题及需求。从属权利要 求则记载了优选的实施方案。可以理解，通过数值限定的数值范围是包括有端点数值的。
【发明内容】
[0008] 在对本发明作详细介绍之前，本领域技术人员可以理解，本发明不仅仅限于文中 特定部分所描述的器件或工具，或者方法部分所描述的方法流程，这些器件或工具及方法 可以做若干变形。同样可以理解，文中的用词只是用于描述特定的实施例而已，并不用于限 制本发明。此外，对于通过数值来限定的参数范围是包括数值端点值的。
[0009] 根据本发明的第一方面，本发明提供了一种具有降低的肽酰胺化活性的用于蛋白 质表达的细胞。
[0010] 如本文中所述的，术语"细胞"同样包括由该细胞产生的细胞系。进一步，由该细 胞或细胞系产生的动物以及基于细胞的表达平台同样属于本发明的保护范围之内。
[0011] 如本文中所述的，术语"用于蛋白表达" 一词是指根据本发明的细胞，其适于工业 生产过程中的蛋白质表达，包括同源和/或异源的蛋白质表达。事实上，根据本发明的细胞 适于工业生产的过程意味着，处于自然环境中的该细胞能够根据自身特性降低肽酰胺化活 性，但是，正因为如此，并没有进行进一步修饰、隔离或处理，不适合工业生产过程的蛋白质 表达，如果存在没有经过进一步修饰、隔离或处理的细胞，并且不适合工业生产过程的蛋白 质表达，不会影响根据本发明的细胞的新颖性。
[0012] 肽酰胺化是一种普遍存在的，往往是多种生物活性肽的翻译后修饰所必经的过 程。肽酰胺化在诸如催化神经内分泌肽以激活a酰胺化产品的过程中发挥作用。
[0013] 然而，在一些情况下，肽酰胺化却是不希望看到的，例如，当形成的酰胺化的氨基 酸作为一种不受欢迎的异质性来源，或者氨基酸变异可能导致蛋白质的活性或免疫原性受 影响，或者酰胺化的氨基酸的含量，例如脯氨酸酰胺的含量，在产生的蛋白质中比在参考蛋 白中更高或更低。
[0014] 在本发明细胞的一个优选的实施例中，降低的肽酰胺化活性是通过如下方法实现 的：
[0015]a)抑制或降低编码用于催化肽a-酰胺化的酶的基因的基因表达；
[0016]b)表达功能异常或失活的用于催化肽a-酰胺化的酶，或者表达具有降低活性 的用于催化肽酰胺化的酶；和/或
[0017]c)抑制或降低用于催化肽a-酰胺化的酶的活性。
[0018] 根据本发明的另一方面，本发明还提供一种在给定细胞中降低肽酰胺化活性的方 法，其包括如下步骤中的至少一步骤：
[0019]a)抑制或降低编码用于催化肽a-酰胺化的酶的基因的基因表达；
[0020]b)表达功能异常或失活的用于催化肽a-酰胺化的酶，或者表达具有降低活性 的用于催化肽酰胺化的酶；和/或
[0021] c)抑制或降低用于催化肽a-酰胺化的酶的活性。
[0022] 根据本发明的一个优选的实施例，降低的肽酰胺化活性是通过对编码催化肽 a_酰胺化的酶的基因进行下述至少一种改造方式来实现的：
[0023]基因沉默（genesilencing);
[0024]基因抑制（geneknock-down);
[0025]基因敲除（geneknock-out);
[0026] 显性负构造体的引入（deliveryofadominantnegativeconstruct);
[0027]条件性基因敲除（conditionalgeneknock-out);和
[0028]基因变异（genealteration)〇
[0029] 本文中的术语"基因表达"是指包括选自下列集合中的至少一种过程：DAN转录成 mRNA，mRNA加工，非编码mRNA成熟、mRNA出核（mRNAexport)、翻译、蛋白质折叠和/或蛋 白质运输。
[0030]所述抑制或降低基因的基因表达是指直接干扰基因表达的方法，包括但不限于： 抑制或降低DNA的转录，例如，通过使用特别设计的启动子相关抑制因子、通过给定启动子 的位点特异性突变或通过启动子交换，或者抑制或降低翻译，例如，通过RNAi诱导的翻译 后基因沉默等。
[0031] 所述表达功能异常或失活的用于催化肽a-酰胺化的酶，或者表达已降低活性的 催化肽酰胺化的酶能够通过例如对编码基因的特定位点或随机突变、插入或删除的方式来 实现。
[0032] 所述抑制或降低用于催化肽酰胺化的酶的活性可以通过例如在蛋白质表达之前 或蛋白质表达的同时通过施加或孵育各自的酶的抑制剂来实现。这些酶的抑制剂包括但不 限于：抑制肽（inhibitorypeptide)、抗体（antibody)、适体（aptamer)、融合蛋白（fusion protein)或者所述酶的模拟抗体（antibodymimetic)，或者所述抑制肽、抗体、适体、融合 蛋白或者所述酶的模拟抗体的片段或受体，或者核酸，或者具有类似结合活性的小分子物 质。
[0033] 其他的抑制酶的活性的方法包括降低培养基中酶的特异性辅助因子。这些酶的特 异性辅助因子，例如铜，作为PAM特异性金属辅助因子（例如，以CuS04的形式存在）；抗坏 血酸盐，其充当PAM的电子给体；分子氧；过氧化氢以及其他本领域技术人员所熟知的或未 来可能发现的物质。
[0034] 基因沉默、基因抑制及基因敲除是指降低基因表达的手段。这些手段能够通过基 因修饰，或者用具有与mRNA转录体与基因二者之一互补配对的寡核苷酸序列进行处理等 方式实现。如果是基因修饰的手段，那么结果会产生一个基因抑制或基因敲除的生物体。如 果基因表达的改变是因寡核苷酸序列与mRNA结合或者是因寡核苷酸序列暂时性的与基因 结合，这会导致暂时性的基因表达改变，而染色体DNA却没有改变，这种手段称为暂态抑制 (transientknock-down)〇
[0035] 在包括有上述介绍的术语的暂态抑制过程中，其中寡核苷酸序列与活性基因的结 合或者与活性基因转录产物的结合会通过阻断转录（基因结合的情况）、mRNA转录产物的 降解（通过小分子干扰RNA(siRNA)或者核糖核酸酶-H依赖的反义过程）或者通过阻断 用于其他功能RNA(如miRNA)成熟的mRNA翻译、mRNA前体的剪切位点或核酸酶酶切位点 (例如，通过吗啉代寡核苷酸（Morpholinooligos)或者其他核糖核酸酶-H依赖的反义过 程（RNase-Hindependentantisense))的方式引起表达下降。其他的引起表达下降的手段 还包括使用shRNA(小发夹RNA，smallhaipinRNA，一种紧致的发夹结构的RNA序列，能够 通过RNA干扰途径来沉默基因表达），使用esiRNA(Endoribonuclease_preparedsiRNAs， 核糖核酸内切酶制备的siRNA，是一种用核糖核酸内切酶对dsRAN(longdouble-stranded RAN，长双链RNA)剪切后产生的siRNA寡核苷酸的混合物）或者RNA诱导的沉默复合物 (RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)的激活。
[0036] 其他的本领域技术人员熟知的执行基因沉默、基因抑制或基因敲除的手段，在本 文中不再赘述，这些手段在本发明中作为常规应用。
[0037] 所述基因敲除是指基因表达被完全阻断的手段，例如，特定基因不起作用或者完 全被移除。基因敲除的实现的方法有多种，这也是本领域技术人员所熟知的。例如一种对 给定基因起主导性的负突变的产生等。这种突变能够通过合适的转座子或者通过本领域技 术人员所熟知的其他方法来诱导的定点突变技术实现（例如，删除、部分缺失、插入或者核 苷酸替换等），在本文中不再赘述，这些应用在本发明中作为常规应用。本发明文中本领域 技术人员认为非常有用的一种新发展的技术是通过使用有针对性的锌指核酸酶来诱导的 基因敲除技术。相应的工具包由SigmaAldrich公司提供的"CompoZRknockoutZFN"。另 一种方法包括使用转录活化剂状效应核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffector nucleases，TALENS)〇
[0038] 所述显性负构造体的引入包括引入一编码功能失调酶的基因编码序列的过程，例 如，通过转染技术实现。所述基因编码序列能够与强启动子功能性耦合，这样的话，该功能 失调酶的基因表达超过了野生型酶的自然表达，这导致了相应的酶活性的有效生理缺陷。
[0039] 所述条件性基因敲除能够以组织特异性或时间特异性的方式阻断基因表达。这可 以通过在目的基因上引入loxP位点这种短序列来实现。同理，其他的本领域技术人员熟知 方法在本文中不再赘述，这些方法应用在本发明中作为常规应用。
[0040] 基因变异作为另一种途径可导致功能失调的基因产物或活性降低的基因产物的 产生。这种途径包括引入移码突变、无义突变（例如，引入提前终止密码子）或者能够导致 整个基因产物功能失调或活性降低的氨基酸替换的突变。这种基因变异可以例如通过诱变 (例如，删除、部分缺失、插入或者核苷酸替换）来实现，也可以通过随机突变或者定点突变 的方式来实现。
[0041] 文中描述的基因沉默、基因抑制、基因敲除、显性负构造体的引入、条件性基因敲 除和/或基因变异的实际应用都是本领域技术人员能够实现的，这些应用在本发明中作为 常规应用。本文所提供的技术指导是完全包括所有能够想到的方法导致抑制或降低编码催 化肽a-酰胺化酶的基因表达的，或者导致功能失调或无效的催化肽a-酰胺化酶表达，或 者具有降低活性的催化肽酰胺化的酶的表达。
[0042] 根据本发明的另一优选实施例，所述细胞是真核细胞。所述真核细胞包括但不限 于：动物细胞（例如昆虫细胞）、植物细胞和真菌细胞。相应的，在本发明提供的一优选实 施例中，该细胞是指动物细胞和/或植物细胞。
[0043] 根据本发明的另一个优选实施例，所述细胞是指哺乳动物细胞。根据本发明的又 一优选实施例，上述细胞包括选自下列细胞中的至少一种细胞：
[0044]幼仓鼠肾细胞（BabyhamsterKidneycells，例如BHK2