后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可以在絹丝虫诸如家蚕的后部絹丝腺中大量地表达目标肽的后 部絹丝腺基因表达单元及具有其的转基因絹丝虫。
【背景技术】
[0002] 家蚕（Bombyxmori)的絹丝腺具有可以在短期间内合成大量蛋白质的能力。另外， 由于家蚕的絹丝腺为大型器官，因此容易摘除，另外还具有如下优点：由于所合成的蛋白质 被贮藏在絹丝腺内腔，所以容易回收。因此，在絹丝腺中表达目标蛋白质的转基因蚕具有作 为蛋白质的大量生产系统的前景。
[0003] 家蚕的絹丝腺在形态学上为图1所示的左右1对器官，分别由前部絹丝腺、中部絹 丝腺及后部絹丝腺这3个区域构成。在后部絹丝腺细胞内，构成作为絹丝的纤维成分的丝 心蛋白的3种主要的蛋白质，丝心蛋白H链（以下，经常简称为"FibH"）、丝心蛋白L链 (以下，经常简称为"FibL"）、及p25/FHX(以下，称为"p25"）进行表达。另外，在中部絹 丝腺细胞内，作为絹丝的包覆成分的明胶样蛋白质，丝胶蛋白进行表达（图1)。在后部絹丝 腺细胞内表达的上述3种蛋白质以FibH:FibL:p25 = 6:6:1的比率形成复合体（silk fibroinelementaryunit;本说明书中，以下称为"SFEU复合体"。），在后部絹丝腺内腔中 被分泌。与此相对，丝胶蛋白在表达后在中部絹丝腺内腔中被分泌。在后部絹丝腺内腔中 被分泌的丝心蛋白其后转移至中部絹丝腺内腔，用丝胶蛋白包覆而作为絹丝吐丝（图1 :非 专利文献1)。因此，将家蚕絹丝腺作为蛋白质表达系统利用的情况下，利用在中部絹丝腺或 后部絹丝腺中特异性地表达的基因表达系统即可。
[0004] 将家蚕絹丝腺作为蛋白质表达系统利用的情况下，迄今为止，确立了作为使用中 部絹丝腺的重组蛋白质表达系统的GAL4/UAS系统（非专利文献2)、或利用组合丝胶蛋白1 启动子及Hr3增强子的系统的大量表达方法（非专利文献3)。
[0005]另一方面，已知后部絹丝腺中的蛋白质合成能力为中部絹丝腺的蛋白质合成能力 的约3倍（非专利文献4)。因此，如果从生产方面判断，与中部絹丝腺相比，后部絹丝腺作 为蛋白质表达系统是更优选的。另外，在后部絹丝腺中所生产的重组蛋白质与茧丝同时分 泌，因此还适于作为絹纤维利用（非专利文献5)。
[0006] 但是，由迄今为止的研宄得知：虽然其它丝心蛋白的构成蛋白质正常地表达，但在 FibH中存在异常的家蚕的突变品系（Nd品系）和在FibL中存在异常的家蚕的突变品系 (Nd-s品系及Nd-sD品系）几乎不能吐丝（非专利文献6)。另外，由上述突变品系的分析表 明：在向后部絹丝腺内腔的FibH、FibL、和/或p25的有效的分泌中，上述SFEU复合体的 形成是重要的（非专利文献7及8)。因此，上述突变品系不能吐丝的原因被认为是：由于 在任一种构成蛋白质中存在异常，因此不能形成SFEU复合体，导致FibH、FibL及p25均 不能从后部絹丝腺细胞向内腔中分泌（非专利文献9)。根据这种观点，在后部絹丝腺细胞 内表达的蛋白质在构成SFEU复合体时仅有效地分泌到细胞外，这是该领域的一般说法。因 此，若要将后部絹丝腺作为蛋白质表达系统利用，必须想办法使目标重组蛋白质作为SFEU 复合体的一部分表达等，以在后部絹丝腺中利用特异性分泌系统。
[0007] 作为使重组蛋白质在后部絹丝腺中作为SFEU复合体的一部分表达、分泌的具体 方法，已知有作为在FibH基因或FibL基因的启动子的下游将FibH或FibL的全部或 一部分和重组蛋白质融合的融合蛋白质（嵌合蛋白质）表达的方法（图2a及b)(非专利 文献1〇、11)。由于这种嵌合蛋白质作为SFEU复合体的一部分被插入，因此向后部絹丝腺的 内腔的分泌会有效地进行。但是，由于插入于SFEU复合体会成为不溶性的，因此为了回收 重组蛋白质，必须进行分泌的SFEU复合体的可溶性化处理。可溶性化中必须利用强的改性 剂进行处理，进而，为了使生理活性地表达，有时也需要将嵌合蛋白质中的丝心蛋白的构成 蛋白质部分裂解。因此，在后部絹丝腺中表达的重组蛋白质不仅回收困难，而且还存在伴有 失去其活性的风险的重大问题。
[0008] 另一方面，还已知不将重组蛋白质作为不溶性SFEU复合体的构成成分，而作为水 溶性蛋白质在后部絹丝腺中表达、分泌的方法。可列举例如在编码目标重组蛋白质的DNA 的上游附加编码P25的信号肽的DNA的方法（图2c)(非专利文献12)。该方法中，目标蛋 白质可作为水溶性蛋白质表达，但存在表达量及分泌效率低的重大问题（非专利文献12)。 另外，还尝试不使用后部絹丝腺特异性的蛋白质的信号肽，而如专利文献1中记载的台湾 兜虫的防御素的表达方法那样，以含有目标重组蛋白质自身的信号肽的状态使该重组蛋白 质在后部絹丝腺中以可溶性化的状态表达的方法。但是，该方法也与上述方法一样，存在虽 然作为目标蛋白质可表达、但是表达量及分泌效率低的问题。
[0009] 根据以上的理由，在该领域中，认为后部絹丝腺在使用转基因蚕的絹丝腺表达系 统、以水溶性的状态简单且大量地生产蛋白质的情况下是不适合的。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1日本特开2005-95063
[0013] 非专利文献
[0014]非专利文献 1InoueS.etal.，2000,TheJournalofBiologicalChemistry， 275(51) ：40517-40528.
[0015] 非专利文献 2TatematsuK.etal.，2010,TransgenicResearch，19 (3) :473_87.
[0016]非专利文献 3TomitaM.etal.，2007,TransgenicResearch，16 (4) :449_465.
[0017]非专利文献 4M.Mondaletal.，2007,CaspianJ.Env.Sci5(2) :63-7.
[0018] 非专利文献5田村俊樹他，2008,農農技術，63卷第7号：320-236.
[0019]非专利文献 6GamoT.etal.，1985,J.seric.Sci.Jpn，54,412-419.
[0020] 非专利文献 7TakeiF.etal.，1984，TheJournalofCellBiology，99 : 2005-2010.
[0021] 非专利文献 8TakeiF.etal.，1987，TheJournalofCellBiology，105 : 175-180.
[0022] 非专利文献 9InoueS.etal.，2004,Eur.J.Biochem. 271 :356_366.
[0023]非专利文献 10KojimaK.etal.，2007，BiosciBiotechnolBiochem，71: 2943-2951.
[0024]非专利文献 11TomitaM.etal.，2003,NatBiotechnol，21 :52_56.
[0025]非专利文献 12RoyerC.etal.，2005,TransgenicRes，14 :463-472.
[0026] 发明概述
[0027] 然而，如果重组肽不作为丝心蛋白的构成成分，而是作为水溶性肽可以在后部絹 丝腺中简单且大量地表达及分泌，则通过其高的蛋白质合成能力可以提高使用转基因蚕的 有用肽的生产效率，另外，由此也可以降低制造成本。
[0028] 因此，本发明的目的在于，开发一种在以家蚕为代表的絹丝虫的后部絹丝腺中可 以大量地表达、分泌水溶性重组肽的后部絹丝腺基因表达单元，提供该基因表达单元被转 入其中的转基因絹丝虫。
[0029] 为了解决上述课题，本发明人等反复进行潜心研宄，使编码将外来的水溶性肽与 来自在中部絹丝腺细胞中特异性地表达的蛋白质的信号肽连接的嵌合肽的基因在后部絹 丝腺中表达，结果，惊人地发现：与现有的后部絹丝腺基因表达系统相比，可以以10~50倍 的效率表达并分泌目标水溶性肽。本申请发明是基于该新见解，具体而言，提供以下的发 明。
[0030] (1) 一种后部絹丝腺基因表达单元，其包含：基因的启动子，所述基因的启动子编 码在后部絹丝腺中特异性地表达的蛋白质；及与该启动子的下游功能性地连接的编码来自 在中部絹丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽的DNA;及连接于其下游的编码不含有丝 心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA。
[0031] (2)如⑴所述的后部絹丝腺基因表达单元，其中，所述信号肽为丝胶蛋白1~3 中任一个的信号肽。
[0032] (3)如⑴或⑵所述的后部絹丝腺基因表达单元，其中，所述在后部絹丝腺中特 异性地表达的蛋白质为FibH、FibL或p25。
[0033] (4) 一种后部絹丝腺基因表达单元，其由（a)第1辅助单元和（b)第2辅助单元构 成，所述第1辅助单元包含：编码在后部絹丝腺中特异性地表达的蛋白质的基因的启动子； 及与该启动子的下游功能性地连接的编码转录调节因子的基因；所述第2辅助单元包含： 该转录调节因子的标靶启动子、与该启动子的下游功能性地连接的编码来自在中部絹丝腺 中特异性地表达的蛋白质的信号肽的DNA、及连接于其下游的编码不含有丝心蛋白的构成 蛋白质的肽的DNA。
[0034] (5)如（4)所述的后部絹丝腺基因表达单元，其中，所述信号肽为丝胶蛋白1~3 中任一个的信号肽。
[0035] (6)如⑷或（5)所述的后部絹丝腺基因表达单元，其中，所述在后部絹丝腺中特 异性地表达的蛋白质为FibH、FibL或p25。
[0036] (7) -种转基因絹丝虫，其具有（1)~（3)中任一项所述的后部絹丝腺基因表达单 J1_1〇
[0037] (8) -种转基因絹丝虫，其具有（4)~（6)中任一项所述的后部絹丝腺基因表达单 J1_1〇
[0038] (9)如（8)所述的转基因絹丝虫，所述第1辅助单元和所述第2辅助单元存在于不 同的染色体上。
[0039] (10)如⑶或（9)所述的转基因絹丝虫，其是将具有所述第1辅助单元的品系和 具有所述第2辅助单元的品系交配而得到的。
[0040] (11)如（7)~（10)中任一项所述的转基因絹丝虫，其中，所述絹丝虫为家蚕、蓖麻 蚕、或柞蚕。
[0041] (12) -种转基因絹丝虫的利记博彩app，其将⑴~（6)中任一项所述的后部絹丝腺 基因表达单元转入作为宿主的絹丝虫中，在后部絹丝腺中表达目标肽。
[0042] (13) -种使用（7)~（11)中任一项所述的转基因絹丝虫制备目标肽的方法。
[0043] 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2012-281330号的说 明书和/或附图中所记载的内容。
[0044] 附图简述
[0045] 图1是在家蚕的絹丝腺及其各部位表达的丝心蛋白的构成蛋白质和絹丝被吐丝 之前的概念图。
[0046] 图2是表示现有的后部絹丝腺中的重组蛋白质表达单元的构成的图。（a)该重组 蛋白质的表达单元具有将在分别编码FibH的N末端区域及C末端区域的基因区域之间融 合编码目标重组蛋白质X的基因（GeneX)而成的融合基因在FibH基因启动子的下游以 可表达的状态连接的结构。（b)该重组蛋白质的表达单元具有将在编码FibL的全长基因 区域的下游融合编码目标重组蛋白质X的基因（GeneX)而成的融合基因在FibL基因的 启动子的下游以可表达的状态连接的结构。（c)该重组蛋白质的表达单元具有将编码p25 的信号肽的基因区域和编码目标重组蛋白质X的基因（GeneX)融合而成的融合基因在p25 基因启动子的下游以可表达的状态连接的结构。需要