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【专利说明】肽 发明领域
[0001] 本发明涉及肽，其至少部分可衍生于VIII因子（FVIII)。所述肽可以用于减少或 阻止VIII因子抑制物抗体的形成（例如在A型血友病治疗和获得性血友病中）。
[0002] 发明背景
[0003] 血友病
[0004] 血友病属于一组可遗传血液病症，其包括A型血友病、B型血友病（Christmas病） 以及冯维勒布兰德氏病（VonWillebrand'sdisease)。
[0005] 在血友病中，由于基本凝血因子部分或完全缺失，血液凝结的能力严重降低，导致 出血时间增加。
[0006]A型血友病是凝血因子VIII的缺陷，而B型血友病是凝血因子IX的缺陷。在两种 疾病中，缺陷基因发现于X染色体上，因此这些病患是X连锁的。A型血友病比B型血友病 常见五倍。
[0007] 血友病是一种终身的遗传基因病患，其影响作为携带者的女性以及遗传病患的男 性。约三分之一的新诊断没有以前的家族史。其出现于世界各地，并在所有人种群体中发 生。在英国，约有6000人受到血友病的影响。
[0008] 血友病患者在损伤后长时间出血。外部损伤例如割伤和擦伤通常不造成严重问 题；通过应用一定程度的压力并覆盖受到影响的区域（例如使用膏药），通常可能止血。
[0009] 主要的问题是进入关节、肌肉和软组织的内出血，其可以自发发生。内出血例如进 入脑部的出血非常难以应对，并可能致命。关节中的反复出血导致剧烈的疼痛并可能导致 关节炎和/或长期关节损伤，导致残疾。
[0010] 血友病的治疗通常是通过置换缺失的凝血因子。在轻度或中度血友病中，可以在 出血发生时给予注射（按需治疗）。然而，在重度血友病中，给予定期预防性注射来帮助血 液凝结，并最小化长期关节损伤的可能性。
[0011]A型血友病的凝血因子置换疗法的潜在严重并发症是中和VIII因子促凝血功能 的抗体的形成。VIII因子抑制物发生于大约25%的重度A型血友病中。由于患有先天性A 型血友病的患者可能是FVIII遗传缺陷的，抑制物的合成是针对施用来阻止或治疗出血事 件的外源蛋白的同种免疫应答。
[0012] ⑶4+T细胞在针对FVIII的免疫应答中扮演中心角色。在被抗原提呈细胞 (APCs)吸收后，FVIII经历蛋白降解为肽片段（Reding等，（2006)Haemophilia12(supp 6) 30-36)。这些肽然后与MHCII类分子联合，提呈在APC的表面。这一复合物然后被FVIII 特异性的CD4+T细胞的T细胞受体识别。在合适的共刺激信号存在下，这一识别最终引起 CD4+细胞指导B细胞的抗体合成。
[0013] 抑制物形成的发生率最初随着VIII因子治疗的数量而增加，但在50-100暴露天 数后似乎达到稳定。抑制物的形成在重度血友病中比在中度或轻度疾病中更为常见，并且 一些分子缺陷（最清楚的是VIII因子轻链中的大缺失和无义突变）似乎偏向于抑制物的 形成。参数例如浓度、置换因子的类型（纯化的或重组的），以及治疗史也可能影响抗体产 生的可能性。
[0014] 带有抑制物的血友病患者的处理是持续的挑战。使用脱敏技术的免疫耐受诱导 (ITI)在一些带有针对VIII因子的同种抗体的相同患者中是成功的。这种治疗方法要求对 因子置换疗法的进行中的暴露，因此是一种长期的策略。
[0015] 虽然ITI可以是成功的，但相当大比例（约30% )的患者未能对ITI响应。带 有高抑制物滴度的患者不太可能对治疗响应。另一个重要的影响因素是ITI开始时的年 龄，当患者超过20岁时，成功率大幅下降（Hay等，（2005)SeminarsinThrombosisand Hemostasis32:15-21)。
[0016]当ITI疗法不成功时，抑制物通常会存留一生，并且因为这些病人通常是高反应 者，必须使用FVIII绕过产品（例如活化的凝血酶原复合物浓缩物（FEIBA?)，以及重组活化 的FVII)治疗出血事件。然而，这些试剂的使用与不良反应关联，例如弥散性血管内凝血， 急性心肌梗塞，肺检子和血检形成（Acharya和DiMichele(2006)BestPractice&Research ClinicalHaematology19:51-66)。
[0017] 免疫抑制疗法有时用于未能对ITI反应的患者。治疗包括施用免疫抑制药物例如 环磷酰胺（cyclophosphamide)、泼尼松（prednisone)、硫挫嗓呤（azathioprine)和环抱素 (cyclosporine)，其非特异性靶向免疫系统。这些治疗可以具有与一般的免疫抑制相关的 副作用。
[0018]对使用Rituximab?(-种针对B细胞⑶20抗原的人源化单克隆抗体）的选择性B细胞耗竭有新的兴趣。然而，在一些使用这种药物治疗的儿童中发生了输注反应、血清病 以及机会性感染（X*iMichele(2007)JThrombHaemost5:143-50)。
[0019] 获得性血友病
[0020] 获得性血友病是一种罕见的自身免疫病患，其在每百万人中影响1到4个人。在 这种病患中，生来没有血友病的受试者形成出针对一种凝血因子例如VIII因子的抗体。据 认为怀孕和自身免疫疾病例如类风湿性关节炎和癌症可能增加形成获得性血友病的风险。 虽然引起其产生的根本免疫机制不同，在响应凝结因子置换疗法中产生的FVIII抑制物的 临床表现和那些在获得性血友病中产生的FVIII抑制物的临床表现类似。
[0021] 获得性血友病患者具有接近25%的死亡率，部分因为获得性抑制物和严重出血并 发症相关。获得性自身抗体抑制物的疗法主要是基于需要控制或阻止急性出血并发症（其 通常威胁生命和肢体），其次是根除自身抗体来恢复正常凝血。
[0022] -些与低滴度自身抗体抑制物（〈5个Bethesda单位）相关的出血可以通过高剂 量FVIII浓缩物的施用有效治疗。猪FVIII浓缩物曾经被认为是用于获得性血友病相关出 血的重要一线疗法，因为其是提供在实验室中实际测量输注后FVIII凝结活性水平的机会 的唯一置换疗法。因为猪血浆库被猪细小病毒污染，这一产品在2004年从市场上移除。现 在，"绕过"试剂是最为常用的，但存在促凝性（thrombogenicity)的潜在风险，并且对于每 个产品仅有约80%的效力。通过血衆除去法（plasmapheresis)和身体外免疫吸附的血衆 置换对于临时减少抑制物滴度，使得足以绕过试剂或FVIII置换提供充分止血可以是必要 的。
[0023]自身抗体抑制物的根除依赖于免疫抑制措施，例如：（1)在3-6周中施用 30% -50%效力的皮质类固醇；（2)使用细胞毒性和骨髓抑制性化疗试剂，例如环磷酰胺、 环孢素、2-氯脱氧腺苷；（3)使用静脉内免疫球蛋白的免疫调节；以及（4)使用利普西单抗 (rituximab)的选择性B淋巴细胞耗竭。Rituximab?的响应者可能要求同时使用类固醇， 而且复发可能响应再治疗。
[0024] 因此，所有目前可用的降低A型血友病治疗相关的同种抗体产生和获得性血友病 中自身抗体产生的方法都有缺点。因此，需要改进的方法来在A型血友病和获得性血友病 中解决抗FVIII抗体的问题。
[0025] 本发明的发明人已经发现，有可能通过使用FVIII衍生肽预耐受化 (pre-toerise)患者来阻止FVIII抑制物抗体的形成，以及通过施用FVIII衍生肽以减少 FVIII抑制物抗体来治疗病患，例如血友病。
[0026] 发明概述
[0027] 因此，本发明的第一个方面涉及能够诱导或恢复对FVIII的耐受性的肽，其至少 部分序列衍生于FVIII。
[0028] 在本发明第一个方面的第一个实施方案中，本发明提供包含FVIII衍生序列 DNMVTFRNQASRPY的肽，其具有以下序列中的一项：
[0029] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 17)
[0030] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 18)
[0031] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 19)
[0032] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 25)
[0033] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 26)
[0034] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 27)
[0035] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 29)
[0036] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 30)以及
[0037] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No.31)。
[0038] 在第二个实施方案中，本发明提供包含FVIII衍生序列PRCLTRYYSSFVNME的肽，其 具有以下序列中的一项：
[0039] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 1)
[0040] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 2)
[0041] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQIDNo. 3)
[0042] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.5)
[0043] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.7)
[0044] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.9)
[0045] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ IDNo.10)
[0046] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.11)以及
[0047] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.13)。
[0048] 在第二个方面，本发明提供包含多种肽的组合物，其包括根据本发明第一个方面 的一种或多种肽。
[0049] 所述组合物可以包含根据本发明第一个方面的第一个实施方案的至少一种肽和 根据第二个实施方案的至少一种肽。
[0050] 所述组合物可以包含具有SEQIDNO. 1的肽和具有SEQIDN0. 17的肽。
[0051] 所述组合物可以是试剂盒的形式，其中所述多种肽是分开提供的，用于分开、随 后、序贯或同时施用。
[0052] 本发明的所述肽或试剂盒可以用于抑制、减轻或阻止VIII因子抑制物抗体的形 成。
[0053] 本发明还提供了此类肽或组合物在制造抑制、减少或阻止VIII因子抑制物抗体 形成的药物中的用途。
[0054] 本发明也提供用于抑制、阻止或减少受试者中VIII因子抑制物抗体的形成的方 法，其包含将这种肽或组合物施用于所述受试者的步骤。
[0055] 所述受试者可以是FVIII缺陷的，特别是所述受试者可以具有A型血友病，并可以 或即将经历VIII因子置换疗法。
[0056] 或者，所述受试者可以具有或有风险染上获得性血友病。
[0057] VIII因子抑制物在表达HLA-DR2的个体中更常找到。因此，通过本发明所述方法 治疗的受试者可以是HLA-DR2阳性的。
[0058] 附图简述
[0059] 图1:修饰的FVIII肽的溶解度
[0060]共测试了 32 种肽：其中 16 种基于FVIII肽PRCLTRYYSSFVNME( "PRCLT"）（SEQID No. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13) ;16 种基于FVIII肽DNMVTFRNQASRPY( "DNMV"） (SEQIDN〇.17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32)。测试了其相对于无 关对照肽（4Y)的溶解度，已知所述无关对照肽对于作为耐受化抗原的应用是足够可溶的。 在图表中，绿色代表至少与4Y-样可溶的肽，橙色代表不太与4Y-样可溶，但相当接近的 肽，红色代表不与4Y-样可溶的肽。编码为绿色的