一种hla-dqb1基因分型的组特异性引物pcr-sbt方法及试剂的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于HLA-DQBl基因分型的分子生 物学检测方法，本发明还涉及该方法所应用的试剂和有关实验参数。
【背景技术】
[0002] 人类白细胞抗原（HLA)基因位于第6号染色体短臂21. 3区域，是调控人体特异性 免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA抗原与同种器官移 植的排斥反应密切相关，器官移植术后移植物能否存活很大程度上取决于供者与受者之间 HLA型别是否相合。准确的HLA分型对选择合适的供者、降低移植物抗宿主病（GVHD)的发 生率、提高移植物的存活率均有重要意义。
[0003] HLA-DQBl属于经典的HLA-II类基因，在免疫应答中起重要作用，现在HLA-DQBl的 分型已被大多数免疫遗传实验室作为常规检测用于移植供受者配对选择。HLA-DQBl有6个 外显子，目前常规检测主要为第2和第3外显子的多态性。HLA-DQBl具有高度遗传多态性， 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)在内含子和外显子区域均有丰 富的分布，如第1内含子中平均每7个核苷酸即存在1个SNP位点，在第2和第3外显子平 均每6个核苷酸有1个SNP位点，并且不同组特异性等位基因 SNP位点不同。熟悉HLA-DQB1 基因这些特点，对于分析HLA-DQB1基因序列确定等位基因型有一定的帮助。
[0004] HLA测序分型为国际通用的组织配型高分辨检测技术，基因测序分型技术的关 键之一在于引物设计和PCR扩增。由于HLA-DQBl每一组等位基因在内含子和外显子均存在 共享序列，为同时检测多组DQBl等位基因多态性，在试剂引物中可能含有多对扩增引物。 在PCR同时扩增多对引物时由于存在竞争作用，某些等位基因会出现优势扩增现象。国外 学者已报道DQBl基因在DQB1*02和DQB*03、DQBI*04等杂合情况下容易导致等位基因漏 检。国内也有研宄报道DQB1*06与DQB1*02杂合时，DQB*06等位基因优先扩增，DQB1*03 与DQB1*02杂合时，DQB1*03等位基因优先扩增，从而导致DQB1*02等位基因漏检。我们 在前期研宄中也发现现有的商用试剂盒虽然可以同步检测HLA-DQBl的第2和3号外显 子，但是也存在类似的等位基因漏检情况。因此，现有的方法存在一定缺陷，建立一种针对 HLA-DQBl单一等位基因的PCR-SBT方法可以保证不同等位基因的有效扩增，对于提供准确 的HLA-DQBl分型结果有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于HLA-DQBl基因分型的组特异性引物 PCR-SBT试剂，以克服现有基因分型技术中的上述不足。
[0006] 为此，本发明采用以下技术方案： 它由用于扩增的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成； 所述用于扩增的引物为： (1) 扩增HLA-DQB1*02组的特异性引物 DQB1*02F :5'-CTCGTCATTCCCTTGAACTG-3' DQB1*02R :5'-AACCACCGGACTTTGATCTG-3'， (2) 扩增HLA-DQB1*03:Ol组的特异性引物 DQB1*0301F :5'-TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG-3' DQB1*0301R :5'-CAGTCCCTCCGAGCTATCAG-3'， (3) 扩增HLA-DQB1*03组（除DQB1*03:01外）和DQB1*04组的特异性引物 DQB1*04F :5'-GATGAGGTGAGCACAGTCGG-3， DQB1*04R :5'-CTCCGAGCTATCAGGACTGG-3'， (4) 扩增HLA-DQB1*05组的特异性引物 DQB1*05F :5'-ACAGCAGGATTTGTCATTTCA-3' DQB1*05R :5'-GTCCTGTCTCCTCGCACTTC-3'， (5) 扩增HLA-DQB1*06:01组的特异性引物 DQB1*0601F :5'-GGAAATACAAGGCAGCAATGA-3' DQB1*0601R :5'-CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC-3'， (6) 扩增HLA-DQB1*06组（除DQB1*06:01外）的特异性引物 DQB1*0602F :5'-CAAGACTGCCTGGACTTAGG-3' DQB1*0602R :5'-AGGACTGGGATTCAGAGCAA-3' ； 所述用于测序的4条寡核苷酸测序引物序列如下： DQB1-2F :5'-GGCCSGTGATTCCYCGCAG-3' DQB1-2R :5'-GGKCRACSMCGCTCACCTC-3' DQB1-3F :5'-CTTTYCCTGTCTGTTACTGC-3' DQB1-3R :5'-GGCCCAYARTAACAGAAACTC-3'。
[0007] 本发明还提供一种HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT方法，它对 HLA-DQBl基因进行分型，包括以下步骤： (1) 制备人基因组DNA ; (2) 提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HLA-DQBl不同等位基因 型序列； (3) 将步骤（2)得到的扩增产物进行双酶切纯化； (4) 提供测序引物，将步骤（3)得到的纯化产物进行测序PCR反应； (5) 将步骤（4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序； (6) 将步骤（5)获得的序列通过软件分析，确定HLA-DQBl等位基因型。
[0008] 所述步骤（2)中的扩增引物为上述6对组特异性引物，所述步骤（4)中的测序引物 为上述4条寡核苷酸测序引物。
[0009] 所述步骤（3)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0010] 本发明中引物设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网 上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据頂GT/HLA数据库（http://www.ebi. ac. uk/imgt/hla/)中HLA-DQBl位点基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列 而获得的。所有引物的设计均避开目前已知的突变位点或采用简并引物方法，以免因位点 的漏检而导致分型错误。本发明中6对寡核苷酸扩增引物分别针对HLA-DQBl位点不同等 位基因组的共有序列设计，每对扩增引物只特异性扩增一组等位基因第2和第3外显子，避 免了其他组等位基因的干扰。测序引物选择HLA-DQBl基因的保守区域设计，4条共同的测 序引物可对不同组等位基因的扩增片段进行双向测序，保证清晰准确检测第2和第3外显 子的全部序列，从而将标本进行精确的分型。
[0011] 本发明在明确HLA-DQBl位点组特异性的基础上，选择不同的组特异性引物扩增 HLA-DQBl位点第2和第3外显子，进而应用共同的测序引物进行双向测序分析，精确地确定 HLA-DQBl的等位基因型。利用这些组特异性引物可以对样本的单体型进行有效分离，在新 等位基因的鉴定方面有重要作用。此外，本发明可有效判定等位基因型的漏检情况，弥补现 有分型方法的不足，有助于准确指定HLA-DQBl等位基因型别。
[0012] 本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，能成功解 决HLA-DQBl位点的准确分型鉴定问题，有利于提高造血干细胞移植供受者HLA配型的准确 性，从而选择更合适的移植供者，降低移植过程中的排斥反应，这对于进一步提高器官移植 的成功率和生存率具有重要的意义。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明中检测标本的HLA-DQBl基因 PCR扩增电泳图谱。1孔为DQB1*02组 扩增片段，2孔为DQB1*03:01组扩增片段，3孔为DQB1*03组（除DQB1*03:01外)和DQB1*04 组扩增片段，4孔为DQB1*05组扩增片段，5孔为DQB1*06:01组扩增片段，6孔为的DQB1*06 组（除DQB1*06:01外）扩增片段。M为DNA marker，分子量分别为2000, 1000,750，500， 250, IOObp0
[0014] 图2-7为本发明检测的HLA-DQBl基因部分测序电泳图谱，图中A、G、C、T分别为 测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。
[0015] 图2为HLA-DQBl基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为 DQB1*02:01。
[0016] 图3为HLA-DQBl基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为 DQB1*03:01。
[0017] 图4为HLA-DQBl基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为 DQB1*03:03。
[0018] 图5为HLA-DQBl基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为 DQB1*05:03。
[0019] 图6为HLA-DQBl基因第2外显子部分多态性序列图谱，样本分型结果为 DQB1*06:01。
[0020] 图7为HLA-DQBl基因第2外显子部分多态性序列图谱，