一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备苷元的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备 苷元的方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss. ex. Fr. ) Karst]隶属担子菌亚门 (Basidiomycetes)、层菌纲（Hymenomycetes)、多孔菌目（Polyparales)、多孔菌科 (Polyporaceae)、灵芝属（Ganoderma)，是一种药用价值很高的食用菌，在我国已有2000多 年的历史。《中国人民共和国药典》（2000版）将灵芝补录，明确指出灵芝具有"补气安神， 止咳平喘"的功效，其所具有的较重要的药理作用有抗肿瘤、抗放疗与抗化疗、抗心肌缺血、 调节血脂、免疫调节、抗缺氧、清除自由基及延缓衰老等，最近的研宄还显示灵芝具有抑制 艾滋病毒增殖的效果。
[0003] 灵芝主要的活性成分有多糖类、三萜类、核苷类、留醇类、生物碱类、呋喃衍生物、 氨基酸多肽类、微量元素、脂肪酸、有机锗等。其中，灵芝多糖和灵芝三萜是其主要的生物活 性成分。灵芝多糖主要的药理作用有：抗肿瘤、免疫调节、抗氧自由基、活化淤血、抗衰老等。 灵芝三萜的主要药理作用有：保肝、抗肿瘤、镇痛、抑制血小板聚集等。
[0004] 大豆异黄酮（Soybean Isoflavone)是一类从大豆中提取出的具有多酷结构混合 物的统称，是一类具有雌激素样作用的具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，也是 最主要的"异黄酮"类植物雌激素之一。其主要成分有3种，即染料木黄酮（Genistein)、大 豆苷元（Daidzein)和大豆黄素（Glycitein)。通常情况下，这三种异黄酮母核与葡萄糖以 β -糖苷键连接，以异黄酮葡萄糖苷形式存在于大豆中，分别称为染料木苷（Genistin)、大 豆苷（Daidzin)和6-甲氧基大豆苷（Glycitin)，含量占大豆异黄酮的97~98%。研宄发 现，大多数的结合型糖苷不能通过小肠壁，真正在体内被吸收而产生生理活性的是游离苷 元Gen和Den。大豆异黄酮除具有弱的雌激素活性外，还具有抗癌、抗氧化、抗溶血、抗真菌 等活性，同时能够有效抑制白血病、骨质增生、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等多种疾病的发 生。
[0005] 一般情况下，大豆异黄酮苷元主要通过以下方式获得：（1)碱水解，但水解得到的 大豆异黄酮苷元很不稳定，容易降解；（2)酸水解，一般所用的酸为盐酸，水解效率虽然很 高，但强酸条件不易实现工业化，同时会使产品色泽、口感及滋气味较差，影响产品品质； (3)酶水解，反应速度快，条件温和，工艺参数容易控制，但酶制品成本高，而利用微生物发 酵的方法直接生产大豆异黄酮苷元可大幅降低成本。
[0006] 微生物转化是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化 反应，具有反应条件温和、操作性强、无环境污染等特点，同时微生物培养具有繁殖迅速，生 长周期短，可以降低成本，易于工业化生产。由于大豆异黄酮分子中糖基的连接键是β-糖 苷键，所以可以利用可分泌β-葡萄糖苷酶的微生物发酵来实现大豆异黄酮苷元的制备。 目前，曲霉被普遍认为是产β-葡萄糖苷酶的优良菌种，尤以黑曲霉的效率最高，但仅限于 实验室研制阶段，黑曲霉β -葡萄糖苷酶的转化效率仍有待提高。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备苷元的方法，该方法获得的 β-葡萄糖苷酶的酶活高，产物大豆异黄酮糖苷元的转化率高。
[0008] 一种灵芝发酵转化大豆异黄酮制备苷元的方法，包括：
[0009] (1)将灵芝接入培养基进行发酵培养，获得含灵芝菌丝体的发酵液；
[0010] (2)对发酵液进行匀浆处理，使灵芝菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液 中，获得粗酶液；
[0011] (3)将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。
[0012] 对发酵液进行匀浆处理，即可破碎发酵液中的菌丝体，释放β -葡萄糖苷酶；释放 后无需提取β-葡萄糖苷酶即可直接用于大豆异黄酮糖苷的转化，转化后得到的大豆异黄 酮苷元包含染料木素（Genistein)、大豆苷元（Daidzein)和黄豆黄素（Glycitein)，其中， 黄豆黄素的含量极低，可以忽略。
[0013] 作为优选，以重量百分比计，所述培养基包括麦芽汁4. 10%，酵母浸出粉1.8%， KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，ρΗ5. 40。其中，糖化后的麦芽汁使用糖度仪测定其 含糖量，试验中所涉及的麦芽汁的用量均以其溶液中的含糖量计，即4. 10%为麦芽汁的含 糖量。
[0014] 作为优选，所述发酵培养的条件为：25~30°C下培养6~8天。
[0015] 步骤（2)中，在0~5°C条件下进行匀浆处理，以避免β-葡萄糖苷酶酶活的降低。
[0016] 通过实验对粗酶液与大豆异黄酮糖苷的反应条件以及粗酶液中葡萄糖苷酶 与大豆异黄酮糖苷的用量关系进行优选
[0017] 作为优选，步骤（3)中，反应的温度为50°C~60°C ;更优选，60°C。
[0018] 步骤（3)中，反应的时间为6~60h;更优选，42h。步骤（3)中，反应液pH值为 4~6〇
[0019] 更优选，步骤（3)中，反应的温度为60°C，反应的时间为42h，反应液pH值为4~ 6〇
[0020] 作为优选，以Ig大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中β -葡萄糖苷酶的用量为10~30U。
[0021] 发酵培养前，将灵芝接入种子培养基中进行培养，培养条件为：28°C下培养8天。
[0022] 作为优选，以重量百分比计，所述种子培养基包括马铃薯1 %，葡萄糖2%，蛋白胨 1.8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，pH 5.5,121°C湿热灭菌 20min，VB1 过滤除 菌。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024] (1)本发明通过深度发酵灵芝获得大量β -葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮制备苷 元，获得的β -葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收 率，同时转化产物还富含灵芝胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发 及工业化生产奠定基础；
[0025] (2)灵芝液体深层发酵具有繁殖迅速，生长周期短等优点，可以降低成本，易于工 业化生产；
[0026] (3)采用灵芝的发酵产物转化大豆异黄酮糖苷，具有反应条件温和，工艺简单、操 作性强、无有机溶剂残留、无环境污染等特点。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明灵芝菌株液体发酵过程中β -葡萄糖苷酶酶活变化；
[0028] 图2为本发明大豆异黄酮添加量对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0029] 图3为本发明温度对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0030] 图4为本发明转化时间对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0031] 图5为本发明大豆异黄酮粗提物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物质含量的示意 图；
[0032] 图6为本发明转化产物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物质含量的示意图（转化 条件：大豆异黄酮5g，60°C，48h)。
【具体实施方式】
[0033] 1、灵芝菌株的液体发酵培养方法
[0034] 各菌株培养保存于斜面培养基中，取4-5块Icm2菌丝块接种到种子液培养基，于 28°C，180rpm培养8d后得灵芝液体种子液。然后按10% (v/v)接种量将各种子液接种到 发酵培养基中，28°C，180rpm培养7d。
[0035] 斜面培养基：马铃薯 1%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. ISKVB10.00 5%，琼脂 2%，121°C湿热灭菌20min，VB1过滤除菌。
[0036] 种子液培养基：马铃薯1%，葡萄糖2%，蛋白胨1.8%，KH2P040. 3%，MgS040. 15%， VB10.00 5%，pH 5· 5,121°C 湿热灭菌 20min，VB1 过滤除菌。
[0037] 液体发酵培养基：麦芽汁4. 10%，酵母浸出粉1. 8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%， VB10.00 5%, pH5. 40〇
[0038] 麦芽汁的制备：取啤酒制备所用小麦芽，按照European Brewery Cenvention(EBC)方法制备麦芽汁，利用手持糖度折光仪测定麦芽汁含糖量，后续实验均以 含糖量（％ )计。
[0039] 2、β -葡萄糖苷酶活力测定方法
[0040] 葡萄糖苷酶活力单位（U)定义为，在pH 5.0, 50°C反应条件下，一分钟时间内 底物被水解释放出1 μ mol的pNP所需要的酶量。
[0041] pH5. 0 的 P-C 缓冲液：称取 Na2HPO4 · 12H20 3. 689g、柠檬酸 1.0 lg 溶于 100mL 蒸馏 水中，调pH至5.0并定容。
[0042] 底物（pNPG)工作液：准确称取pNPG 150. 65mg，完全溶解于100ml pH5. 0的P-C缓 冲液中备用。
[0043] β -葡萄糖苷酶酶活测定：离心收集灵芝液体发酵菌丝，加入适量蒸馏水后超声 破碎，4°C下 1000 Og 离心 15min，取 100μΙ 上清与 200 μ1 5mM pNPG 混匀，50°C保温 30min， 加入2ml lmol/L Na2CO3*止反应并显色，于400nm下测定吸光值。
[0044] β -葡萄糖苷酶酶活（U/g) = (x