一种受锈菌诱导的小麦启动子的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种受锈菌诱导的小麦启动子，利用 该启动子可用于小麦基因工程育种等方面。
【背景技术】
[0002] 启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始 与否的DNA序列，位于受其调控的基因上游某一固定位置，紧邻转录起始位点，长度一般约 为一百至一千个碱基。根据作用方式及功能，可将启动子分为组成型、特异型及诱导型启 动子。其中组成型启动子可在所有组织中启动下游基因的表达，所启动基因的表达具有 持续性，如编码肌动蛋白和微管蛋白等植物持家基因 （housekeeping gene)的启动子；特 异型启动子仅在特定组织或时期内具有起始转录的功能，如种子贮藏蛋白的胚乳特异启 动子。诱导型启动子仅在特定外界环境因素的刺激下才促使目的基因的表达模式发生变 化。虽然利用生物信息学软件可以预测启动子包含的各类调控元件，但是对于启动子的 确切的功能分析往往需要实验验证，如报告基因的融合表达验证（Thilmony等，GM Crops Food，2014, 5:36-43)，或对启动子捕获载体（Promoter trapping)的转基因后代进行分析 (Jennifer 等，2012, PLoS One, 7: e41916)等。
[0003] 近年来，小麦（Triticum aestivum L.)基因组学的迅速发展为小麦重要基因的 分离与功能研宄提供了大量候选基因，为进一步有效开展基因工程育种奠定了重要基础。 在基因功能研宄及基因工程改良中，目前广泛采用的是目标基因的过量表达与RNAi沉默 研宄。玉米泛素基因（ubiquitin)启动子、花椰菜花叶病毒（CaMV)35S启动子等组成型启 动子是上述研宄中最常用的启动子元件。然而，组成型启动子启动的外源基因在受体植物 中非特异、持续、高效表达不但会造成浪费，而且引起非目标性状或其它重要农艺性状的变 化，弱化基因工程改良的预期目标（Brunner等，Plang Biotechnol J. ,2011,9:897-910; Morran 等，Plang Biotechnol J·，2011，9:230-249 ;Risk 等，Plant Biotechnol J.，2013, 11:847-54)。
[0004] 利用诱导型启动子，实现对目的基因表达模式的精细控制是解决上述问题的有 效策略。例如在大麦中利用组成型启动子过量表达小麦TaDREB3转录因子基因，虽然可 以提高抗冻性，但开花时间推迟3-6周，而利用低温诱导启动子0sWRKY71或TdCor39,转 基因大麦不但抗冻性明显提高，而且其它农艺性状基本不受影响（Kovalchuk等，Plant Biotechnol J. ,2013,11:659-670)。抗旱基因 LcNECDI在矮牵牛中组成型表达可导致植 株矮化、种子发芽延迟，而利用胁迫诱导启动子rd29A驱动的过量表达，不但可以提高抗 旱性，而且可以消除对植株生长及种子休眠特性影响（Estrada-Melo等，Horticulture Research, 2015, 2:15013)。因此，诱导型启动子的研宄与利用在基础研宄和植物基因工程 育种方面具有重要的应用价值。
[0005] 目前已在植物中鉴定多个诱导型启动子，可响应高温、低温、干旱、盐碱、病原菌等 胁迫信号的刺激，并被用于目的基因的过量表达或RNAi沉默研宄。但是锈菌诱导型启动子 鲜有报道。小麦条锈病、叶锈病和杆锈病是世界范围内危害小麦生产的重要病害。锈菌可 通过气流进行高空远距离传播，造成大面积锈病流行，危害严重年份可造成减产10-30 %。 抗病品种的培育是防治小麦锈病的重要措施。改良基因工程技术、培育更好的抗病品种是 现有技术亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个受病原菌诱导的小麦启动 子及其应用。该启动子来源于小麦类萌发素蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1所示， 长度为672bp，发明人用含有该启动子和绿色荧光蛋白（GFP)基因的重组表达载体转化模 式植物二穗短柄草（Brachypodium)，验证了该启动子受锈菌诱导而增强表达。利用该特 性，可以把该启动子应用于麦类作物目的基因或基因片段的诱导型过量表达或RNAi沉默 研宄，以实现基因的功能分析或基因工程育种。
[0007] 本发明所述的过量表达植物抗病基因（Wang等，Funct Integr Genomics, 2015, 15:375-81)或沉默表达病原菌的致病基因 （Wei 等，Plant Biotechnol J.，2015, doi: 10. 1111/pbi. 12352)，正逐渐被应用于小麦的抗病育种中，发明人基于这种 技术基础获得了本发明的技术方案。
[0008] 发明人首先提供了一个受锈菌诱导的小麦启动子，发明人将其命名为PTaGER4， 其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 该启动子来源于小麦类萌发素蛋白基因，可以是下述核苷酸序列之一：
[0010] 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的DNA序列；
[0011] 基本上相当于SEQ ID NO. 1所示的经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所 衍生的具有相同启动子功能的DNA序列；
[0012] 或者在严格条件下与SEQ ID NO. 1所示限定的序列杂交且具有启动子功能的DNA 序列；
[0013] 可以认为在核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的DNA序列的基础上基于不破坏其启 动子功能的合理变化都属于本发明所涵盖的范围。
[0014] 在获得上述启动子的基础上，发明人将该启动子与报告基因 GFP连接并重组至植 物表达载体。利用农杆菌介导法进行二穗短柄草的遗传转化。对转基因材料接种短柄草锈 菌，通过对接种前后的叶片组织进行报告基因的表达分析与荧光检测，判定PTaGER4启动 子受锈菌诱导的特性。
[0015] 利用上述发现的特性，利用PTaGER4启动子开展目的基因的过量表达，可以使目 的基因在受到病原菌诱导后增强表达，避免了持续过量表达可能对转基因植株的生长发育 或农艺性状造成的严重影响。
[0016] 利用PTaGER4启动子开展目的基因的RNAi沉默研宄，可在受到病原菌诱导后抑制 目的基因的表达。
[0017] 综上所述，本发明的发明人提供了一个受锈菌诱导的小麦启动子，并验证了该启 动子受锈菌诱导而增强表达的特性，利用该特性可以把该启动子应用于麦类作物目的基因 或基因片段的诱导型过量表达或RNAi沉默研宄，以实现基因的功能分析或基因工程育种。
【附图说明】
[0018] 图1.本发明所述启动子转化二穗短柄草后，农杆菌侵染后短柄草愈伤组织的GFP 荧光检测结果灰度图；
[0019] 图中C为本发明所述启动子转化后二穗短柄草，D为组成型启动子-玉米泛素启 动子转化后二穗短柄草，由图可知，筛选获得的短柄草愈伤组织为阳性转基因材料，其中可 观察到明显的绿色荧光信号，说明本发明克隆的PTaGER4序列具有启动子的功能。
[0020] 图2.利用本发明所述启动子获得的转基因短柄草受锈菌侵染后GFP基因的表达 水平变化结果灰度图；
[0021] 图2A中左侧为接种前的转基因短柄草叶片，右侧为锈菌接种10天后的发病叶 片；
[0022] 图2B中1和2为锈菌侵染前叶片中GFP基因的表达水平，3和4为锈菌侵染后叶 片中GFP基因的表达水平，
[0023] 结果表明，接种前叶片中的GFP基因表达量很低，而发病后叶片中的GFP表达量明 显提尚；
[0024] 图3.利用本发明所述启动子获得的转基因短柄草受到锈菌诱导后GFP荧光观察 结果灰度图；
[0025] 图中A和D为空白对照载体pIPKbOOl (GFP上游为多克隆位点序列）的转基因短 柄草；
[0026] B和E为载体pIPKb002 (玉米泛素启动子驱动GFP)的转基因短柄草；
[0027] C和F为本发明所述启动子转化后的转基因短柄草；
[0028] ABC为诱导前，DEF为诱导后，
[0029] 结果发现在不接种锈菌情况下，空白对照（pIPKbOOl)没有GFP荧光信号（A)，对照 载体（pIPKb002)的转基因短柄草叶片可见GFP荧光信号（B)，表明本发明所使用的载体系 统可正常工作，本发明所述启动子转化后的转基因短柄草（C)叶片中也观察到GFP荧光信 号，表明该启动子具有转录功能；
[0030] 锈菌接种10天后，取发病叶片的锈菌孢子堆附近区域进行观察，空白对照（D)及 阳性对照（E)无明显变化，而本发明所述启动子转化后的转基因短柄草（F)叶片中的GFP 荧光信号明显增强，表明其可受锈菌诱导而增强表达的特征。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人 员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明 作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本 领域现有技术。
[0032] 实施例1小麦GER4基因启动子的克隆：
[0033] 利用大麦类萌发素蛋白基因 GER4c的编码序列（GenBank :418E01)，在小麦中国 春基因组数据库(http: //www. cerealsdb. uk. net)中搜索同源序列，通过序列拼接获得了 长度为1.4kb的序列跨叠群，其中包含小麦GER同源基因5 '端两个外显子及其上游序列。 根据小麦同源基因的上游序列设计引物，引物末端分别添加 StuI和SpeI酶切位点序列， 正向引物序列：5' -AAAAGGCCTCTTTGCAGGCACTAACTTCATA-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:2 所示；反向引物序列：5' -TTTACTAGTTGATTTCAGCTCCTTTGGGTC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0034] PCR 扩增使用 Phusion 高保真酶（Thermo Scientif ic 公司，货号 F-530S)。
[0035] PCR扩增体系包含 5 XPhusion HF Buffer 10 μ l、10mM dNTPs 1 μ 1、10 μ mol 引物 2.5yl、DMS0 1.5