一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用
【技术领域】
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[0001]本发明属于医药生物领域，具体涉及一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用。
【背景技术】
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[0002]转录因子NF-E2相关因子2 (Nrf2)是一种作用于二相代谢酶基因上游的抗氧化反应元件(ARE)上的转录因子，是多种细胞保护基因表达的主要调节者。二相代谢酶或称二相抗氧化酶，主要有血红素加氧酶(HO-1，即热休克蛋白32)、醌氧化还原酶(NQOl)、谷胱甘肽转移酶(GST)等，二相代谢酶的表达主要通过Keapl-Nrf2-ARE通路调控。ARE位于几乎所有二相酶基因的5'启动区，多种不同类别的物质能通过ARE来诱导二相酶基因的转录。正常状态下Nrf2与其分子伴侣Keapl结合于胞浆中，处于功能抑制状态，并由Keapl将其带入泛素化途径进行降解，因此在细胞中的半衰期很短。在细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2从Keapl中解离以稳定状态进入细胞核内并与ARE结合，最终导致其下游的二相代谢酶的转录。Nrf2作为细胞防御系统中最重要的保护性转录因子，在氧化应激状态时Nrf2的活化和核转位通过多种途径发挥抗氧化应激、抗凋亡和抗炎症作用。近年来研宄发现，Nrf2具有广泛的细胞保护作用，对减轻多种组织损伤发挥重要作用。另外，Nrf2是Fas诱导凋亡的抑制物，过表达Nrf2可以保护细胞免于Fas诱导的凋亡，Nrf2还可以通过增加细胞内GSH水平来调节对死亡信号的敏感性，减轻组织的缺血再灌注损伤。
[0003]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)存在于多种组织之中，例如可在骨髓、脂肪、肌肉、羊水、角膜基质和脐带组织、胎盘提取不同来源的间充质干细胞。骨髓来源的间充质干细胞最先被发现，目前国外临床试验多用第三方捐赠的骨髓来源，主要缺点是不易获取，且获取的过程对健康捐赠者有侵入性操作。脐带来源的间充质干细胞活性好，生长繁殖能力强，而且来源丰富，脐带分娩后一般予以丢弃，可变废为宝，并且利用脐带来源的间充质干细胞无伦理问题，对捐赠者无害。目前全球范围内登记的间充质干细胞移植治疗的临床试验超过200多项。一些临床试验初步结果显示MSCs对多种疾病如心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合症acute respiratory distress syndrome (ARDS)、骨髓移植后发生的移植物抗宿主病graft-versus-host disease (GVHD)等都有一定的治疗效果，但其疗效受MSCs在体内存活时间的限制。
[0004]MSCs是良好的载体，经过基因修饰的间充质干细胞可能具有较好的应用前景。经过基因修饰后，MSCs的免疫调节和抗炎作用可得到增强，细胞活力和在体内的生存时间也得到增强。大多数临床前、临床研宄所用的基因修饰的MSCs均由病毒载体对MSCs进行修饰。病毒载体因其转染效率而被广泛运用，常见的类型有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。腺病毒是瞬时转染，治疗剂量的腺病毒载体修饰的MSCs需要大量的腺病毒，其经济效益比难以达到满意。逆转录病毒和慢病毒载体修饰可将感兴趣的基因插入MSCs基因组中，稳定表达并可以随着细胞分裂传给子代，具有大量扩增的潜力。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006](I)、PCR 技术扩增人源 Nrf2 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)；
[0007]⑵、将步骤(I)获得的PCR产物进行纯化，双酶切后与骨架质粒PLV-CMV-Xba1-BamH1-GFP连接，构建了 Nrf2慢病毒重组载体；转化后挑选单克隆，摇菌，取菌液行PCR扩增确定阳性克隆；
[0008](3)、将阳性克隆进行测序，确定无突变后大量扩增；
[0009](4)、将步骤(2)获得的Nrf2慢病毒重组载体与辅助质粒按质量比10:5:5:5的比例共转染至293FT细胞，转染后分两次收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，过滤上清，即获得病毒；所述的辅助质粒分别为pCMSCV、PMDG和PMO II，它们与骨架质粒构成四质粒慢病毒包装系统。
[0010](5)、将步骤(4)获得的病毒感染第3?5代hUC-MSCs细胞，获得稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs。
[0011]优选，步骤⑴的PCR反应体系为:50uL反应体系包含25uL 2XTaq plus PCRMaster Mix，正向和反向引物各luL，cDNA模板luL，无酶水22uL ;PCR反应条件为:预变性940C 3min，变性94°C 30s，退火54°C 30s，延伸72°C 2.5min，从变性自延伸结束一共35个循环，72摄氏度5min。
[0012]优选，步骤(4)中所述的共转染293FT细胞，具体共转染步骤为:在培养皿内接种合适密度的293FT细胞，要求转染前达到80%以上，将步骤(2)获得的Nrf2慢病毒重组载体、pCMSCV、PMDG, PMO II按质量比10:5:5:5的比例稀释于Opt1-MEM中，另外吸取Lipo2000进行稀释，室温静置后将两者混合，轻轻混匀，静置；分别加入培养皿中，轻轻混匀；转染6h后更换成含有10%胎牛血清DMEM培养基，分别在24h及48h后收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，0.45uM PVDF膜过滤器过滤上清，获得导入重组质粒包装成Nrf2重组慢病毒，分装冻存于-80°C冰箱或直接用于感染细胞。
[0013]优选，步骤(5)中所述的感染第3?5代hUC-MSCs细胞，具体感染步骤为:感染前一天接种细胞于培养瓶中，至第二天感染时密度约为30%，感染前半小时，加入感染增敏剂，感染时将病毒液和培养基1:1稀释，过滤后以此病毒液将培养瓶中的培养液置换出来，6小时换一次病毒液，共感染3次。
[0014]临床上间充质干细胞的临床试验一般取10代以内，本发明选取第3?5代的hUC-MSCs作为感染慢病毒对象，以期获得较为初代的细胞达到治疗目的。
[0015]本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs ο
[0016]本发明的过表达Nrf2基因的细胞株MSCs增加了细胞活力，且在缺氧及氧化应激条件下具有更强的抗凋亡特性，因此，本发明的第三个目的是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs在作为临床前研宄MSCs的良好工具细胞中的应用。
[0017]本发明的第四个目的是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs在制备增进临床前实验MSCs移植的药物中的应用。
[0018]本发明的293FT细胞为人胚肾细胞，购自中国科学院上海生命科学研宄院细胞资源中心。
[0019]本发明的hUC-MSCs细胞购自中山大学附属第三医院生物治疗中心。
[0020]本发明的辅助质粒pCMSCV、PMDG和PMO II及四质粒慢病毒包装系统购自广州永诺生物科技公司。
[0021 ] 本发明通过在人间充质干细胞中稳定过表达Nrf 2基因，增加其细胞活力，兼具在缺氧的条件下具有更强的抗凋亡特性；在体外获得治疗水平数量的Nrf2-MSCs，可作为临床前研宄MSCs的良好工具细胞。
【附图说明】
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[0022]图1是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs⑶和对照组(A)经过15h缺氧后细胞活力情况；
[0023]图2是过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其对照组经过15h缺氧后用western-blot检测凋亡标志物caspase3变化情况；
[0024]图3是NCB1-Blast比对功能预测PCR产物；
[0025]图4是PCR反应结果及重组质粒建立，其中，A是PCR获得的人源Nrf20RF，B是重组载体阳性克隆菌液PCR产物；
[0026]图5是重组载体阳性克隆测序结果；
[0027]图6是稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs (B)及其不含插入基因的空载对照组(A)，因其骨架质粒均带有GFP，故我们可以从图中可见慢病毒感染效率可。
[0028]图7是过表达结果验证，采用western-blot的方法检测到在MSCs中成功过表达Nrf-2o
【具体实施方式】
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[0029]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0030]实施例1:
[0031]1、PCR技术扩增人源Nrf2(来源于人胚肾细胞)开放阅读框(open readingframe, ORF)
[0032]1.1引物设计
[0033]在NCBI上找到Nrf2的Gene ID:4780，在其ORF起始密码子(atg)前方寻找正向引物，反向引物在终止密码子(tag)后寻找，然后将其反向互补得到反向引物。分别在正向引物和反向引物前面加上XbaI和BamHI酶切位点及保护碱基，引物序列如下:
[0034]正向引物Fw: CGATTCTAGATTCCTGCTTTATAGCGTGCAAA
[0035]反向引物Rv:ATATGGATCCTCACATCACAGTAGGAGCTT
[0036]经过NCB1-Blast比对功能预测所设计的引物PCR产物特异性较好，只有一种产物即Nrf20RF片段，如图3所示。
[0037]1.2PCR 扩增
[0038]模板:以293FT 为模板，TRIZOL法(试剂采用 life technologies TRIZOL regent，货号:15596-018)提取RNA，利用Roche公司的反转录试剂盒(货号:4379012001)反转录为cDNA再以此为模板按以上条件和步骤做PCR。
[0039]ORF的全长扩增利用德国DBI公司的2XTaq plus PCR Master Mix为基础反应体系(DBI,公司，货号:DB-2032)，50uL 反应体系包含 25uL 2 X Taq plus PCR Master Mix，正向和反向引物各luL，cDNA模板luL，无酶水22uL。
[0040]PCR反应程序为:预