鹅t淋巴细胞表面分子cd4的检测方法及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及鹅T淋巴细胞表面分子⑶4的检测方法及 试剂盒。
【背景技术】
[0002] T淋巴细胞是宿主细胞免疫系统中最重要的免疫活性细胞之一，除直接介导细胞 免疫功能外，还对机体免疫应答的调节起关键作用。未成熟T细胞前体到成熟T细胞的分 化依赖于T细胞表面受体的信号传导，反映在胸腺细胞表面不同程度的表达CD4和CD8表 面共受体分子。最终，能在外来抗原入侵机体时被激活为效应细胞从而发挥细胞免疫效应 的成熟T淋巴细胞是CD4或者CD8单阳性的效应淋巴细胞。CD4分子是一种单链跨膜糖蛋 白，包含有一个疏水跨膜区，一个较长的胞浆区和一个胞外区，该胞外区含有4个类免疫球 蛋白的功能区。在免疫应答中，CD4分子对MHC II类分子有特异的亲和力，能与MHC II类 分子结合，从而增强T淋巴细胞与靶细胞的结合。因此，在生产实际中检测CD4分子即代表 检测到⑶4+T淋巴细胞。
[0003] 免疫学方法检测抗体最常见的检测模式是间接酶联免疫分析（ELISA)。ELISA的 基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍 保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物 与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加 入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相 关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结 果，使测定方法达到很高的敏感度。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检 测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应 用。
[0004] 监控T细胞的数量，对于商品化疫苗免疫前后宿主免疫状态的监控，对于了解机 体的免役状态，对于宿主感染疾病进程的监控，及对于确定抗感染治疗及机会性感染预防 性治疗方案，评估药物疗效等方面均具有十分重要的意义。到目前为止，国内外已有人、 鼠、猪、牛、羊、鸡、鸭等种属的T细胞表面CD4双抗体夹心ELISA试剂盒的商品化供应。然 而，有关鹅T细胞免疫的研宄较少且相对滞后。目前，仅美国MyBioSource公司出售的Goose sCD4(SCD4)ELISA Kit(Cat. N〇:MBS020139)，说明书指出用于检测鹅可溶性CD4的水平。并 且，值得注意的是，该试剂盒是使用鼠抗人sCD4单克隆抗体为一抗，进行样品的检测。由于 生物物种遗传进化的远近，物种之间序列存在不同的差异。据我们前期研宄数据显示鹅CD4 氨基酸与人CD4氨基酸的序列一致性仅26%。基于上述的数据，我们推测该试剂盒并不能 有效、全面、准确的检测鶴体CD4水平。而且，迄今为止，尚未见有可使用抗鶴CD4抗体为一 抗的鹅T细胞表面CD4双抗体夹心ELISA试剂盒的商品化产品。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，首先，本发明提供了一种鹅CD4多克隆抗体，该鹅CD4多克隆抗体是以 鹅CD4胞外区重组蛋白为抗原免疫动物而得到，特异性强；鹅CD4多克隆抗体可用于定性或 定量检测鹅T淋巴细胞表面分子CD4,也可用于制备定性或定量检测鹅T淋巴细胞表面分 子CD4试剂盒；其次，本发明提供了 一种鹅T淋巴细胞表面分子CD4双抗体夹心ELISA检 测试剂盒，该试剂盒易于推广应用，适合临床与生产实践上大批量地检测样品；第三，本发 明提供了一种鹅T淋巴细胞表面分子CD4双抗体夹心ELISA检测方法，该检测方法是基于 上述的鹅CD4多克隆抗体进行检测的，其灵敏性高、特异性强、重复性好、省时省力、操作简 便；第四，本发明还提供了一种鹅CD4胞外区重组蛋白的制备方法，该方法是通过构建原核 表达重组质粒在原核生物中大量表达鹅⑶4胞外区重组蛋白。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] 鹅CD4多克隆抗体，以鹅CD4胞外区重组蛋白为抗原免疫动物，得到鹅CD4多克隆 抗体；所述鹅CD4胞外区重组蛋白的序列如SEQ ID NO :3所示，该鹅CD4多克隆抗体是以鹅 CD4胞外区重组蛋白为抗原免疫动物而得到，特异性强。
[0008] 鹅⑶4多克隆抗体可用于定性或定量检测鹅T淋巴细胞表面分子⑶4,也可用于制 备定性或定量检测鹅T淋巴细胞表面分子CD4试剂盒。
[0009] 本发明所述的一种鹅T淋巴细胞表面分子⑶4双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所 述试剂盒至少包括所述双抗体，所述双抗体中至少一种抗体采用权利要求1所述的鹅CD4 多克隆抗体。
[0010] 进一步，所述的一种鹅T淋巴细胞表面分子⑶4双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所 述双抗体均采用权利要求1所述的鹅CD4多克隆抗体。
[0011] 进一步，所述的一种鹅T淋巴细胞表面分子⑶4双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所 述双抗体包括鼠抗鹅CD4多克隆抗体和兔抗鹅CD4多克隆抗体，所述鼠抗鹅CD4多克隆抗 体为捕获抗体，所述兔抗鹅CD4多克隆抗体为检测抗体；所述鼠抗鹅CD4多克隆抗体是以鹅 CD4胞外区重组蛋白为抗原免疫鼠，得到鼠抗鹅CD4多克隆抗体；所述兔抗鹅CD4多克隆抗 体是以鹅CD4胞外区重组蛋白为抗原免疫兔子，得到兔抗鹅CD4多克隆抗体；所述鹅CD4胞 外区重组蛋白的序列如SEQ ID NO :3所示。
[0012] 本发明的试剂盒检测灵敏性高、特异性强、重复性好，易于推广应用，适合临床与 生产实践上大批量地检测样品。
[0013] 本发明所述的一种鹅T淋巴细胞表面分子⑶4双抗体夹心ELISA检测方法，所述 双抗体包括鼠抗鹅CD4多克隆抗体和兔抗鹅CD4多克隆抗体，具体包括如下进行的步骤：
[0014] 1)鼠抗鹅CD4多克隆抗体和兔抗鹅CD4多克隆抗体的制备
[0015] 以鹅CD4胞外区重组蛋白为抗原免疫鼠，得到鼠抗鹅CD4多克隆抗体；以鹅CD4胞 外区重组蛋白为抗原免疫兔子，得到兔抗鹅CD4多克隆抗体；所述鹅CD4胞外区重组蛋白的 序列如SEQ ID NO :3所示。
[0016] 2)鹅T淋巴细胞表面分子⑶4双抗体夹心ELISA定量检测
[0017] 以步骤1)所得到的鼠抗鹅CD4重组蛋白的多克隆抗体为捕获抗体，所得到的兔抗 鹅CD4重组蛋白的多克隆抗体为检测第一抗体，以HRP-羊抗兔IgG为检测第二抗体，以鹅 CD4蛋白标准品，进行ELISA分析，制备标准曲线；然后取待测样品，以步骤1)所得到的鼠 抗鹅CD4重组蛋白的多克隆抗体为捕获抗体，所得到的兔抗鹅CD4重组蛋白的多克隆抗体 为检测第一抗体，以HRP-羊抗兔IgG为检测第二抗体，进行ELISA分析，判断待测样品中是 否含有鹅T淋巴细胞表面分子CD4,然后根据所制备标准曲线计算待测样品中所含鹅T淋巴 细胞表面分子CD4的含量。本发明中应用双抗体夹心法测定待测样品中可溶性淋巴细胞表 面蛋白CD4水平，基本原理为：用纯化的捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被捕获 抗体的微孔中依次加入待测样品，再加入检测第一抗体，然后与HRP标记的检测第二抗体 结合，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用 下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的可溶性抗原呈正相关。用酶标仪在450nm波 长下测定吸光度（0D450数值），通过标准曲线计算样品中可溶性抗原浓度。本发明的鹅T 淋巴细胞表面分子CD4双抗体夹心ELISA定量检测方法，其灵敏性高、特异性强、重复性好、 省时省力、操作简便。
[0018] 进一步，优选的，以HRP-羊抗兔IgG为检测第二抗体。
[0019] 进一步，所述的一种鹅T淋巴细胞表面分子⑶4双抗体夹心ELISA检测方法，所述 ELISA分析的具体方法为：将所述捕获抗体包被于酶标板孔中，于4°C孵育过夜，次日采用 PBST充分洗板，然后采用含有BSA的PBS封闭，PBST充分洗涤后，每孔中加入鹅CD4蛋白 标准品或待测样品进行反应，采用PBST洗板后，每孔中加入检测第一抗体进行孵育，采用 PBST洗板，然后每孔中加入检测第二抗体进行孵育，采用PBST洗板，每孔加入TMBM2O2底 物溶液进行显色反应，最后以〇. 25 %氢氟酸终止液终止显色反应，读取波长450nm光密度 值即0D450nm值。
[0020] 本发明所述的鹅CD4胞外区重组蛋白的制备方