一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物、探针及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术（Lateral Flow Assay)检测牛传染性鼻气管炎病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引 起的牛传染性鼻气管炎，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上呈多种表现类型，特 别是该病能引起免疫抑制，继发性的细菌感染能导致更严重的呼吸道疾病。目前此病在世 界范围内广泛流行，且该病严重影响着国际牛业生产贸易，已被世界动物卫生组织（OIE) 列为B类传播性疾病。我国于20世纪70年代末从新西兰进口的奶牛中检测到IBRV，由于 没有很好的免疫防护措施，随后我国多数省份的牛群中均有此病毒感染，对牛群的肥育、产 奶和繁殖影响极大，给牛场造成巨大的经济损失。目前对该病的诊断方法主要有病原分离、 PCR方法、ELISA试验和血清中和试验等，由于这些方法需要精密的仪器以及繁琐的试验程 序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。因而亟需建立一套快速、准确、简便的诊断 方法，为临床现场检测及疫情监测等提供新一代的检测技术与手段。
[0003] 重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplif ication，RPA)，是一种不同 于PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚 合酶三种酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA 中寻找同源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配 对形成复制所需的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补 链，对模板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。 在RPA扩增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5'荧光标记的探针，探针标记的荧光 基团30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶 nfo识别切割，产生新的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信 号与扩增产物的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析 试纸条上显示。
[0004] 目前对于RPA技术的研宄尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于IBRV 检测的报道。本发明系首次采用RPA技术建立快速检测IBRV的方法，并通过特异性和灵敏 度评价，可用于临床现场检测，为IBRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
【发明内容】
[0005] 针对RPA技术应用于IBRV检测领域的空白，本发明提供了一种准确、快速、简便检 测IBRV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒DNA粗提取并进行RPA等温扩增， 结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，具有 灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于非实验室环境下临床现场 检测，具有广泛的应用前景。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0007] -种用于通过RPA技术检测IBRV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探针序列如SEQ ID No. 3所示。
[0008] 正向引物：5' -TTCCGACCAGCGCCGAATCTTGGATGCAGTACT-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0009] 反向引物：5' -GGCCAAAACCGCTTTCAGAAGCAGAGCAAGGTGA-3'（5' -端用 Biotin 标 记）；（SEQ ID No. 2)
[0010] 探针序列：5' -CCGCAAAGTGCCGAGGGATGTCCTTGTAGT【dSpacer】 CAGGTCCACCTTCCGCT-3'（探针5' -端用FAM标记，距离5' -端30个碱基左右的位置处用 dSpacer替代一个碱基，3'端用C3_spacer阻断）。
[0011] 需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp， 探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度 的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。 RPA技术正处于起步研宄阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引 物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引 物进行优化、筛选才能得到。
[0012] 本发明还提供了一种检测IBRV的试剂盒，该试剂盒中包含有用于通过RPA技术检 测IBRV的引物和探针组合。
[0013] 进一步的，该试剂盒中还包括有：IBRV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水和 侧流层析检测试剂。IBRV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水与引物和探针组合一起构 成扩增体系。
[0014] 所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置 换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白（SSB)、280mM醋酸镁（MgAc)溶液。
[0015] 所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0016] 所述IBRV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物对的上游和下游设计引物：
[0017] 上游引物：5' -GCCAAGCGCAGCAGGCAGGTGAAT-3'（SEQ ID No. 4);
[0018] 下游引物：5' -CGACTGGGCGTACATCTCGGAGAA-3'（SEQ ID No. 5);
[0019] 以IBRV的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μ L:10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5yL、2. 5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5yL(5U/yL)、模板 2yL， 10 μ mol/L的上下游引物各2 μ L，灭菌超纯水加至50 μ L。反应程序为94°C预变性3min，然 后进入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共进行31个循环；72°C延伸10min，最后停止于4°C。 PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，（为常规的载体， 商业化购买到）蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的 重组质粒为IBRV阳性对照模板。
[0020] 具体的，一种检测IBRV的试剂盒，每50 μ L扩增体系中含有正向引物、反向引物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探针 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，IBRV 阳性对照模板 2 μ L，Rehydration 缓冲 液29. 5 μ L，去离子水11. 2 μ L和醋酸镁溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0021] 本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测IBRV的方法，步骤如 下：
[0022] (1)应用快速提取病毒基因组DNA试剂盒提取细胞培养病毒上清液的IBRV DNA ;
[0023] (2)根据IBRV保守区域设计RPA特异性引物和探针，向RPA扩增试剂盒推 荐反应的50 yL扩增体系中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 μ mol/L)，探针 0· 6 yL(10 ymol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 缓冲液，11. 2 yL 去离子水和 2. 5 μ L醋酸镁溶液（280mM)，于含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反应管中，恒温水浴 锅内38 °C反应25分钟；
[0024] (3)取I UL扩增产物，应用侧流层析试纸条进行检测，若侧流层析试纸条上显现 出检测带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。
[0025] 应用上述方法可以筛选出一套可快速有效检测出IBRV成分的引物及探针组合。
[0026] 以已知病毒滴度为8. OX IO7TCID5cZmL的IBRV用去离子水进行10倍系列稀释后， 提取DNA后进行同步检测，结果显示可以检测到0. STCID5tl的靶标分子，证明该方法具有较 高的灵敏度。
[0027] 以8. OX Io3TCID5qIBRV样品的DNA作为模板，利用上述优化的引物