检测ezh2基因的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测EZH2基因第7、8、17号外显子 突变率的引物，采用普通PCR技术和Sanger测序，可用于快速检测骨髓增生异常综合征患 者体内EZH2基因多态位点的突变情况。
【背景技术】
[0002] 骨髓增生异常综合征（MDS)是一组异质性克隆性疾病，其特征是血细胞减少，髓 系细胞一系或多系发育异常，无效造血，骨髓造血功能衰竭以及演变为急性髓系白血病的 风险增加，近年来发现MDS患者存在表观遗传调节子（epigenetic regulator)基因如EZH2 等基因的突变，提示这些基因的突变可能参与了 MDS的发生。
[0003] EZH2基因位于人类第7号染色体上，总长76978bp，共20个外显子。EZH2基因编 码的蛋白为一组蛋白甲基转移酶。EZH2基因在MDS中突变率达6%，多亚型均可见，难治性 贫血（RA)是MDS相对早期阶段，在这类患者中检测到EZH2突变，说明该基因异常是疾病发 生的早期事件。EZH2基因可能参与MDS发病机制，Bejar等运用基因测序及质谱基因分型 法对493例诊断为MDS的患者检测了 18种基因的点突变，对这些突变进行COX多因素回归 分析发现，EZH2突变与患者的外周血小板数减少、血红蛋白含量降低、骨髓幼稚细胞数量增 加有明确联系，EZH2突变对整体生存率有预后不良的趋势。另外Nikoloski等和Ernst等 通过对EZH2发生的缺失、错义及移码突变的研宄发现，EZH2突变是髓系恶性血液病（包括 MDS)的不良预后指标。目前导致MDS的具体机制尚不明确，但对EZH是的突变检测无疑能 一定程度上提示不良预后。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测EZH2基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可 用于快速检测骨髓增生异常综合征患者体内EZH2基因多态位点的突变情况。所述检测 EZH2基因多态热点突变情况的引物，包括：
[0005] 扩增EZH2基因的引物，其碱基序列为：
[0006] EZH2-7F ： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
[0007] EZH2-7R ：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
[0008] EZH2-8F ： TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
[0009] EZH2-8R ：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
[0010] EZH2-17F ： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
[0011] EZH2-17R :AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
[0012] 进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
[0013] 检测EZH2基因的测序引物喊基序列为：
[0014] CQ F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0015] CQ R:AACAGCTATGACCATG。
[0016] 进一步地，引物序列EZH2-7F和EZH2-7R是扩增EZH2基因第7外显子序列的引物， 引物序列EZH2-8F和EZH2-8R是扩增EZH2基因第8外显子序列的引物，引物序列EZH2-17F 和EZH2-17R是扩增EZH2基因第17外显子序列的引物。
[0017] 本发明还提供了检测EZH2基因第7、8、17号外显子突变情况的方法，包括以下步 骤：
[0018] 1.抽提血液/中的DNA ;
[0019] 2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA ;
[0020] 3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
[0021] 4.对测序结果进行判断，确定EZH2基因是否发生突变；
[0022] 其中PCR扩增引物为：
[0023] 扩增EZH2基因的引物，其碱基序列为：
[0024] EZH2-7F ： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
[0025] EZH2-7R ：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
[0026] EZH2-8F ： TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
[0027] EZH2-8R ：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
[0028] EZH2-17F ： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
[0029] EZH2-17R :AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
[0030] 进一步地，测序引物喊基序列为：
[0031] 检测EZH2基因的测序引物喊基序列为：
[0032] CQ F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0033] CQ R:AACAGCTATGACCATG。
[0034] 本发明还提供了一种检测EZH2基因多态突变位点的试剂盒，包括：
[0035] ⑴血液DNA抽提试剂；
[0036] (ii)检测体系PCR扩增反应液；
[0037] (iii)测序体系试剂；
[0038] 其中PCR扩增反应液引物为：
[0039] ( i )扩增EZH2基因的引物，其碱基序列为：
[0040] EZH2-7F ： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
[0041] EZH2-7R ：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
[0042] EZH2-8F ： TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
[0043] EZH2-8R ：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
[0044] EZH2-17F ： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
[0045] EZH2-17R :AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
[0046] 进一步地，测序引物喊基序列为：
[0047] CQ F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0048] CQ R:AACAGCTATGACCATG。
[0049] 有益效果：本发明设计了扩增EZH2第7、8、17号外显子序列的引物。采用PCR技 术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到 最佳。EZH2基因的突变类型不定，因此本发明所述引物既能将所述EZH2全部7、8、17外显 子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比 较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计 多个探针，成本高，检测难度大。
【附图说明】
[0050] 图1为EZH2基因在染色体上定位图。
[0051] 图2为EZH2-7F/R的电泳图，M为Marker DL 2000,1-24为送检的MDS患者血液 样本1-24号，如图2所示，引物EZH2-7F/R扩增有效，且条带单一。
[0052] 图3为EZH2-8F/R的电泳图，M为Marker DL 2000,1-24为送检的MDS患者血液 样本1-24号，如图3所示，引物EZH2-8F/R扩增有效，且条带单一。
[0053] 图4为EZH2-17F/R的电泳图，M为Marker DL 2000,1-24为送检的MDS患者血液 样本1-24号，如图4所示，引物EZH2-17F/R扩增有效，且条带单一。
[0054] 图5、6、7分别为样本1、2、3的EZH2第7、8、17号外显子野生型测序截图。
【具体实施方式】
[0055] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议