一种用于动物组织基因组dna快速提取试剂盒及提取方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于动物组织基因组DNA快速提取试剂盒及提取方法和应用，属 于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 全基因组是细胞或组织中包括编码序列和非编码序列在内的全部基因信息。几乎 所有的生命信息均可以从全基因组中发现，包括与动物疾病相关的基因表达与调控。目前， 病原学检测与分子诊断是临床检测中常见的技术，其敏感性与特异性与DNA提取的纯度和 浓度有很大关系，直接决定了检测的结果。在动物疾病检测与分子诊断中，高灵敏度与特异 性的分子诊断已逐步取代血清学检查。因而，获取高纯度与高浓度的基因组DNA是动物病 原菌科研和临床检测中的第一步，其决定了扩增结合和诊断的特异性。
[0003] DNA提取是分子生物学研宄中常用的一种技术，目前市场上有多种DNA提取方法。 动物组织中含有大量的蛋白质、盐类及杂质，其性质与核酸的性质非常相似，难以从提取的 DNA中分离出，在动物组织DNA提取的过程中，很容易与DNA共同沉淀，并且难以分离，往往 造成提取的DNA纯度和浓度不够，影响了后续的扩增和测序。
[0004] 为降低或清除动物组织中的蛋白质、盐类及杂质，现有的DNA提取过程中常常有 污染，并且步骤繁琐，提取过程时间较长。如高氯酸钠法、SDS法和尿素法等提取方法，但这 些方法需要样本量较大，并且苯酚类等有机物容易在DNA溶液中残留，特别是在后续的PCR 扩增过程中会干扰扩增过程，影响扩增结果，使得该方法的应用受到一定的限制。
[0005] 目前市场上采用的方法为：（1)采用氯仿、苯酚抽提法来去除蛋白质、盐类和杂 质。苯酚和氯仿是DNA提取过程的变性剂，反复抽提可以去除蛋白质、盐类和杂质。但苯酚 和氯仿对人体有较大的毒性，挥发性较强，并且整个提取过程步骤繁琐，耗时较长，往往容 易导致DNA降解，并且增加能耗和试验成本。（2)提取DNA的首要步骤为裂解样品，目前市 场上公开的方法为多为水浴裂解法，需要15分钟到1个小时，裂解时间较长。
[0006] 对于动物组织组织而言采用分子生物学方法来研宄其病原菌诊断，首先要进行的 就是样品中细菌或病毒的DNA提取。能获取不同种类的细菌DNA或不同种类病毒的DNA，以 及基因组的完整性、纯度和浓度，是从动物组织中提取DNA用于动物病原菌诊断研宄的首 要目标。因此，需要一种适于用于动物基因组DNA快速提取试剂盒，才能满足当前快速分子 诊断的需求，保障畜牧业的健康发展。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的：在于提供一种用于动物组织基因组DNA快速提取试剂盒及提取方 法和应用，本试剂盒操作简便、省工省时，整个提取过程只需6分钟，可以满足样品较多和 快速提取DNA的需求，为动物病原菌快速诊断和养殖业的健康发展提供技术支持和理论基 础。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种用于动物组织基因组DNA的快速提取试剂盒，包括以下试剂：裂解液、冲洗液1、冲 洗液2、无水乙醇和纯净水，其中裂解液、冲洗液1、冲洗液2的组成分别为： (1) 裂解液：异硫氰酸酯的浓度为I. 5~2. 5 M，EDTA的浓度为30~50 mM，盐酸胍的浓度 为15~35 mM，十二烷基氨基酸的浓度为10~30 mM ; (2) 冲洗液1 :浓度为65~85 mM的Tris-HCl，体积比75%的乙醇，pH 7. 0 ; (3) 冲洗液2 :浓度为1~3 mM的Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7. 5。
[0009] 所述的用于动物组织基因组DNA快速提取试剂盒中： (1) 裂解液：异硫氰酸酯的浓度为2 M，EDTA的浓度为40禮，盐酸胍的浓度为25禮， 十二烷基氨基酸的浓度为20 mM ; (2) 冲洗液1 :浓度为75 mM的Tris-HCl，体积比75%的乙醇，pH 7. 0 ; (3) 冲洗液2 :浓度为2 mM的Tris-HCl，体积比80%的乙醇，pH 7. 5。
[0010] 利用所述的DNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，包括以下步骤： (1)将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取； (1) 取液体状的动物组织20 μ 1~100 μ 1，或取研磨后成糊状的动物组织20mg~100mg， 加500 μL裂解液，70°C水浴3-5 min，12000 rpm 30 S，分离出上清液； (2) 将上清液转入离心管中，加500 μ 1无水乙醇，分次转到DNA纯化柱上，12000 rpm 离心30 S ;得到粗提的DNA，倒掉收集管中的废液； (3) 用500 μ 1冲洗液1冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液； (4) 用600 μ 1冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液； (5) 用500 μ 1冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液； (6) 再次12000 rpm离心30 S，去除残留在纯化柱上的冲洗液； (7) 将DNA纯化柱转到另一离心管，加50 μ 1纯净水，12000 rpm离心30 S，即可得到 病毒及组织基因组的DNA，于-20°C保存备用。
[0011] 所述固体状的动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏；所述液体状的动物组织 为全血、血浆、血清或动物分泌物； 所述的试剂盒在用于动物组织基因组DNA快速提取中的应用。
[0012] 本发明的积极有益效果： 本发明的动物组织基因组DNA快速提取试剂盒，可以快速提取动物组织的DNA，用于动 物病原菌的快速诊断，又可以用于分子遗传学研宄、临床基因诊断及动物疾病诊断。本发明 亦的试剂盒可以用于其他同类组织DNA的提取和病原菌的诊断。
[0013] 本试剂盒的样品经过裂解后，基因组DNA被吸附在DNA吸附柱上，然后用纯净水冲 洗即可得到全基因组DNA。操作简便、省工省时，整个提取过程只需6分钟，可以满足样品较 多和快速提取DNA的需求，为动物病原菌快速诊断和养殖业的健康发展提供技术支持和理 论基础。
[0014] 本发明的试剂盒用于提取动物组织(如心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏)、全血、血浆、 血清和动物分泌物(乳液、鼻液）的基因组DNA，此基因组DNA可用于RT-PCR反应，RAPD、 AFLP、RFLP及病毒基因组扩增。
[0015] 本发明适用于所有科研单位、临床病原检测、分子遗传学研宄、临床基因诊断及动 物疾病诊断和疾病控制中心使用，具有广阔的市场前景和较好的经济效益。
[0016] 说明书附图 图I :1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的电泳图。
[0017] 泳道M为DNA Marker，条带大小自上而下分别为2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp,250 bp,100 bp〇
[0018] 泳道I为使用该试剂盒提取心脏组织基因组的电泳图。
[0019] 泳道2为使用该试剂盒提取肝脏组织基因组的电泳图。
[0020] 泳道3为使用该试剂盒提取肺脏组织基因组的电泳图。
[0021] 泳道4为使用该试剂盒提取脾脏组织基因组的电泳图。
[0022] 泳道5为使用该试剂盒提取肾脏组织基因组的电泳图。
[0023] 泳道6为使用该试剂盒提取全血基因组的电泳图。
[0024] 泳道7为使用该试剂盒提取血浆基因组的电泳图。
[0025] 泳道8为使用该试剂盒提取血清基因组的电泳图。
[0026] 泳道9为使用该试剂盒提取乳液基因组的电泳图。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1:一种用于动物组织基因组DNA快速提取试剂盒及提取方法 试剂盒试剂：包括裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和纯净水。
[0028] 各试剂成分： (1) 裂解液：异硫氰酸酯的浓度为2 M (mol/L)，EDTA的浓度为40 mM (mmol/L)，盐酸 胍的浓度为25 mM