一种纯化凝血因子viii的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纯化凝血因子VIII (FVIII)的方法和通过本发明的方法获得含有重 组人凝血因子VIII(rhFVIII)的组分。
【背景技术】
[0002] 血友病是一种遗传性疾病，其降低人体控制血液凝结或凝固的能力。A型血友病是 血友病中最普遍的一种。A型血友病是一组X染色体隐性遗传的凝血功能障碍性疾病，以 循环中凝血因子VIII (FVIII)含量不足或功能缺陷为特征，可导致外伤后出血或自发性出 血。男性A型血友病的发病几率是5000-10000分之一。最初治疗血友病A是采用全血或 血浆进行FVIII替代治疗。用这些方法即使大量输注只能获得低水平的FVIII，经常无法 有效止血。全血或血浆替代疗法的另一缺点是患者需要住院治疗。二十世纪60年代研制 出的冷冻血浆掀开了血友病A的现代治疗史。冷沉淀的输注不会引起血容量负荷过重的问 题，但由于该产品需要冷冻，且单次剂量即需10-20人所献血浆来制备，这使得冷沉淀的使 用受到限制。
[0003] 冻干FVIII浓缩物是血友病治疗重大飞跃。高纯度FVIII产品与血浆相比已浓缩 了近百倍，且无需冷冻储存。注射容积明显缩小，更便于家庭治疗。这一治疗进展显著改善 了血友病患者的生活质量。现在血友病患者大多数情况下可在家中治疗出血，并可采用预 防治疗来预防出血、接受必需的外科手术治疗，从而减少缺课误工，拥有更加积极而有意义 的生活，并延长预期寿命。FVIII纯化的通常是不同沉淀法与层析法步骤的组合，所述沉淀 法例如冷沉淀法、氢氧化铝沉淀法等，所述层析法主要例如离子交换层析步骤、免疫亲和层 析步骤和凝胶过滤层析步骤。
[0004] 早期由血浆提取的冻干FVIII浓缩物常常会将乙型肝炎病毒或丙型肝炎 病毒传播给受血者。在二十世纪七十年代后期，某些人血浆受到了人免疫缺陷病毒 (immunodeficiency virus,HIV)的污染。病毒感染的严重危害迫使血楽性凝血因子VIII产 品的制造商研发新的病毒灭活措施，如加热灭活或溶剂/去污剂处理，以最大限度防止致 病性病毒传播。自1995年以来，由于采用了这些生产步骤，加上对供体的严格筛查和检测， 使得FVIII产品安全可靠，极大控制住乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及HIV通过该产品的传 播。大多数情况下，这些措施已能够防止患者感染甲型肝炎病毒或细小病毒B1。
[0005] 但仍然存在传播不明血源性病原体的可能。因此利用先进的重组DNA技术，完 成了非血浆源性FVIII的研发。在20世纪90年代，第一个重组凝血因子VIII (rFVIII) 产品上市，到现在有三种不同的具有高纯度的（全部不含VWF)的rFVIII产品（Eriksson 等，the manufacturing process for B-domain deleted recombinant FVIII. Seminars in Hematology. Vol 38, No2，Suppl. 4(April) ,20001 :24-31。）
[0006] 目前用于纯化rFVIII的方法
[0007] 目前由于大部分文献（R. K，Eriksson，C. Fenge，E. Lindner-Olsson，et al :The manufacturing process for B-Domain Deleted Recombinant Factor VIII, Seminars in Hematology, Vol38, No2, Suppl4(April),2001 ：pp24-31 ；Anna-Lisa Smeds, Sollentuna, Sweden, Process for purifying factor viii. US patent no. 6, 005,082, Dec21,1999 ； Wyeth / Genetics Institute, Cambridge, MA, data on file ；Almstedt A, Sandberg H, Smeds A-L, et al ：Process for purify, ing factor viii. US patent no. 5, 831, 026, Nov3,1998), 提到用于纯化rFVIII的方法大多是阴阳离子层析柱及免疫亲和层析柱，但由于FVIII形成 的聚集很难用上述方法进行去除，想要获得生产满足药典规定的纯度标准的rFVIII时，必 须引入凝胶过滤层析分离，但该纯化方法需要对上样前的蛋白进行浓缩，而且收集下来的 蛋白液被稀释，不利于蛋白富集，分离流速慢，载量低，而且填料成本高。
[0008] 因此需要开发新的FVIII的纯化方法。具体地说，需要引入新的去除聚集体的层 析纯化方法，以避免使用分离流速慢、载量低、填料成本高的凝胶层析。
[0009] 羟基磷灰石（CalO (P04) 6 (OH) 2,简称CHT)由于具有特殊的表面结构特性及其微 孔管道结构，从而使得CHT具有与各种无机离子和有机物的吸附和交换的性能，并且具有 与生物活性大分子的非特异性吸附作用。多孔CHT微球材料作为色谱分离介质，具有规则 球形和内部连通微孔，性质稳定，分离效率高，适用于蛋白质、核酸等多种生物分子的分离 提纯。
[0010] 根据文献（Bayele，Η. K. , Murdock，P. J. , and Pasi，K. J. , Residual factor VIII-Iike cofactor activity ofthioredoxin and related oxidoreducatase, Biochim. Biophys. Actal800, 398-404, 2010)，由于FVIII含有23个半胱氨酸，其中有3个是处于游 离状态，有四个半胱氨酸还不清楚是否游离，因此它们易被氧化，形成次磺酸衍生物而影响 生物活性。
[0011] 氨基酸和二肽类氨基酸如蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等都能与金属离子螯 合，所以它们为良好的辅助抗氧化剂。食品科学工作者发现，丙氨酸末端为氮的9种二肽 比任何一种氨基酸的抗氧化能力都强。其中尤以丙氨酸-组氨酸、丙氨酸-酪氨酸、丙氨 酸-色氨酸3种二肽抗氧化能力最强，值得大力开发。
[0012] 因此本发明的一个目的是描述另一种纯化方法。意图获得这样的rhFVIII终产 物，其满足药典所定义的标准并且其可以在技术上以合适的方式使用，特别是rhFVIII的 生产。而且本发明的方法使用羟基磷灰石层析纯化步骤，并且省却载量低、流速慢的层析步 骤，如凝胶过滤层析。并且在纯化过程中添加抗氧化剂来防止FVIII的氧化。
[0013] 本发明的方法提供rhFVIII的纯化方法，生产出来的产品满足以下的质量标准： 宿主细胞的异源蛋白含量小于〇. 1% ;宿主细胞的DNA含量小于IOOpg / mg;生物活性至 少6000IU / mg的，SEC-HPLC纯度大于98%的FVIII的蛋白。因此其可配制成最后的临床 药物。
【附图说明】
[0014] 图1阳离子交换层析分离FVIII各组分SDS-Page电泳检测图谱
[0015] 泳道1表示细胞培养液离心上清泳道2表示经预处理后的待上样样品
[0016] 泳道3表示流穿峰泳道4表示冲洗峰泳道5表示洗脱峰泳道6表示碱峰
[0017] 图2阳离子交换层析纯化层析图谱
[0018] 图3阳离子交换层析洗脱峰（SP P) SEC-HPLC检测图谱
[0019] 图4羟基磷灰石层析纯化层析图谱
[0020] 图5羟基磷灰石层析纯化FVIII各组分SDS-Page电泳检测图谱
[0021] 泳道1表示流穿峰泳道2表示冲洗峰泳道3表示洗脱峰
[0022] 图6羟基磷灰石层析纯化流穿组分SEC-HPLC检测图谱
[0023] 图7羟基磷灰石层析纯化洗涤组分SEC-HPLC检测图谱
[0024] 图8羟基磷灰石层析纯化洗脱组分（CHT P) SEC-HPLC检测图谱
[0025] 图9免疫亲和层析