拟南芥抗橡胶树白粉菌基因roh1的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及拟南芥抗橡胶树白粉菌基因 ROHl的应用。
【背景技术】
[0002] 橡胶树白粉病是由橡胶树白粉菌（Oidium heveae)引发的一种真菌病害。该病发 生时间，以每年春节前后橡胶树开始萌芽或抽出古铜色叶开始，如遇气温偏凉、空气湿度大 的天气，若未及时采取喷药防治，白粉病会在3~5天后造成大面积胶树新抽叶感病。嫩叶 感病初期，叶正面或反背面出现银白色蜘蛛网状菌丝，而后逐渐扩大，在叶表面长出白色粉 状物，形成大小不一的不规则粉斑（图1)。发病严重时，叶片正反两面布满白色粉状物，严 重的叶片主脉或侧脉生长成畸形，整个叶片不能正常伸长，皱缩，遇到高温时，叶变黄，最终 脱落（图2)。不脱落的病叶会留下黄褐色坏死斑。如当年发生白粉病害较重又得不到有效 控制，将导致橡胶树大量新抽叶片落叶，使橡胶树不能正常开割，对当年胶乳产量有显著影 响。
[0003] 在世界范围内，橡胶树白粉病得不到有效的控制将对当年胶乳产量有显著影响， 造成巨大的经济损失。当前，我国对橡胶树白粉病的防治主要以化学防治为主，对环境造成 了严重污染。因而，从分子水平进行抗白粉病基因的筛选及抗病育种是一个非常有希望的 解决橡胶树白粉病的途径。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供ROHl蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体 的用途。
[0005] 本发明的一个目的是提供ROHl蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体 在调控植物抗病性中的应用；
[0006] 所述ROHl蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[0007] 上述应用中，所述ROHl蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0008] 上述应用中，所述调控植物抗病性为提高植物抗病性。
[0009] 上述应用中，所述病的病原菌为橡胶树白粉菌；所述植物为单子叶植物或双子叶 植物；所述双子叶植物具体为十字花科植物。所述十字花科植物尤其具体为拟南芥突变体 N680465或拟南芥突变体N680496。
[0010] ROHl蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在培育抗病转基因植物中 的应用也是本发明保护的范围。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种培育抗病转基因植物的方法。
[0012] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将ROHl蛋白编码基因导入目的植物，得到转 基因植物，所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物；
[0013] 所述ROHl蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[0014] 上述方法中，所述ROHl蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0015] 上述方法中，所述ROHl蛋白编码基因通过重组载体导入目的植物；
[0016] 所述重组载体为将所述ROHl蛋白编码基因插入表达载体，得到的表达ROHl蛋白 的重组载体。
[0017] 上述病的病原菌为橡胶树白粉菌。
[0018] 上述方法或应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体 为十字花科植物。所述十字花科植物尤其具体为拟南芥突变体N680465或拟南芥突变体 N680496。
[0019] 本发明的实验证明，本发明从橡胶树表达谱分析发现，橡胶树含有大量 TIR-NB-LRR类抗性蛋白，由于拟南芥AtEDSl在橡胶树上的同源基因 HbEDSl可以功能互补 拟南芥AtEDSl突变引起的抗性减弱，推测橡胶树存在与拟南芥类似的抗性机制。本发明将 ROHl基因互补ROHl突变的拟南芥突变体，得到转基因植物恢复野生型拟南芥的抗橡胶树 白粉病表型。因此证明，ROHl为抗橡胶树白粉病基因，可用于培育抗病育种奠定了非常好 的基础。
【附图说明】
[0020] 图1为橡胶树白粉菌在橡胶树上的致病图片。
[0021] 图2为橡胶树白粉菌在橡胶树叶片上的后期致病图片。
[0022] 图3为橡胶树白粉菌在拟南芥野生型和相应突变体，以及橡胶树GT-I品系上的致 病图片。
[0023] 图4为橡胶树白粉菌在拟南芥野生型和相应突变体上激活的细胞死亡结果Bar = IOOuM0
[0024] 图5为橡胶树白粉菌在拟南芥野生型和相应突变体上激活的活性氧产生结果Bar =IOOuM0
[0025] 图6为橡胶树白粉菌在拟南芥野生型和相应突变体上激活的胼胝体沉积结果 与Col-O相比进行统计学分析P〈0. 01)
[0026] 图7为橡胶树白粉菌在拟南芥野生型和相应突变体上激活的致病相关基因 PRl表 达结果（**与Col-ο相比进行统计学分析P〈0. 01)。
[0027] 图8为考马斯亮蓝染色橡胶树白粉菌在拟南芥上及其相应突变体上的侵染结果 Bar = lOOuM。
[0028] 图9为橡胶树白粉菌在拟南芥野生型和相应突变体，以及橡胶树GT-I品系上产生 的分生孢子计数结果（**与Col-O相比进行统计学分析P〈0. 01)。
[0029] 图10为橡胶树白粉菌在拟南芥野生型和突变体rohl以及ROHl转基因植株上的 致病图片，分生孢子产生结果（**与Col-ο相比进行统计学分析P〈0. 01)。
[0030] 图11为ROHl转基因植物蛋白检测结果。
【具体实施方式】
[0031 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例1、与橡胶白粉病菌抗性相关基因 ROHl的筛选
[0034] I、与橡胶白粉病菌抗性相关通路确定
[0035] 橡胶白粉病菌HO-73,记载在如下文献中：橡胶树白粉菌收集及DNA和RNA提取方 法比较，广东农业科学，2013年第11期，134-139.万三连，梁鹏，宋风雅，张宇，刘文波，缪卫 国，郑服丛。
[0036] 橡胶树白粉菌能否侵染模式植物拟南芥，在拟南芥上介导的是怎样的一种相互作 用，以及拟南芥是否可以作为工具来研宄橡胶树白粉菌的致病机理，目前仍然是未知的。
[0037] 通过将橡胶白粉病菌HO-73接种橡胶树GT-I品系、拟南芥野生型Col-O以及拟南 芥突变体edsl，pad4, rarl，ndrl，nprl，NahG和sid2的叶片。接种10天后，发现在橡胶树 GT-I叶片上出现了明显的白粉病病斑，有趣的是，在拟南芥Col-O叶片上出现黄化，坏死的 表型，这种表型依赖于EDSl，PAD4, RARl和SA通路的相关基因 NPRl，NahG以及SID2,但不 依赖于NDRl (图3)。进一步试验发现，Oidium heveaeHNl 106在Col-O叶片上激发大量的 细胞死亡（图4)，活性氧产生（图5)，胼胝体沉积（图6)和致病相关基因的剧烈表达（图 7)，并且这些表型同样依赖于EDSl，PAD4, RARl和SA通路，但不依赖于NDRl。
[0038] 通过显微镜观察，接种Oidium heveae HN1106 10天后，在Col-O叶片上仅仅可 以看到散在的真菌孢子以及微量的菌丝生长，不能看到分生孢子的产生；在突变体edsl和 pad4上，可以观察到大量的菌丝生长以及大量分生孢子的产生；在rarl突变体上可以看到 大量菌丝的生长，但不能看到分生孢子的产生；SA通路的突变体和ndrl突变体表现出与野 生型相同的表型（图8,9)。
[0039] 上述结果表明，橡胶树白粉菌可以被拟南芥识别激活抗病反应，并且抗病基因的 功能依赖于EDSl，PAD4,但不依赖于NDRl。
[0040] 2、与橡胶白粉病菌抗性相关基因 ROHl的筛选
[0041] 提取86个依赖于EDS1，PAD4、但不依赖于NDRl信号通路的拟南芥突变体的基因 组DNA，PCR鉴定后，并且初步获得了 58个基因的突变体纯合系。将橡胶树白粉菌分别接 种于58个突变体纯合系上，筛选出1个对橡胶树白粉菌感病拟南芥突变体N680465。进一 步订购了该突变基因的另一个位点插入突变体N680496。出售公司：NASC，The European Arabido