无限制酶的靶标富集的利记博彩app
【专利说明】无限制酶的靶标富集
[0001]发明背景
[0002]分子生物学中的一些分析方法(例如，测序文库制备)需要将衔接子(adaptor)序列放置在富集的DNA片段的末端以提供操作所述片段的方法。例如，可将一个或多个衔接子连接到富集的DNA片段上以产生连接衔接子的片段，可使用结合位点存在于添加的所述衔接子中的引物对连接衔接子的片段进行扩增和/或测序。
[0003]发曰月概沐
[0004]本文提供了用于富集存在于随机剪切的基因组DNA中的靶片段的多种方法。在一些实施方式中，所述方法可涉及使随机剪切的基因组DNA与晕环(halo)探针杂交以产生第一环状复合物，然后酶促消化所述基因组片段的突出末端(overhanging end)。另一些实施方式可涉及使随机剪切的基因组DNA与RNA寡核苷酸杂交以产生RNA/DNA双链体，所述RNA寡核苷酸包含与所述随机剪切的基因组DNA的片段杂交的区域。然后可以酶促消化所述RNA/DNA双链体中基因组片段的突出末端。由此得到的具有确定末端的经消化基因组片段可被连接到晕环探针的一种或多种寡核苷酸上。然后可对经消化的基因组片段进行扩增和测序。
[0005]附图简沐
[0006]本领域技术人员将理解，下述附图仅用于阐释目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
[0007]图1示意性阐释了晕环探针的两种实施方式。
[0008]图2示意性阐释了所述方法的一种实施方式。
[0009]图3示意性阐释了所述方法的另一种实施方式。
[0010]图4示意性阐释了一种可对产物DNA分子进行测序的方法。
[0011]定义
[0012]在更详细描述示例性实施方式之前，给出下列定义以阐释和定义说明书中所用术语的含义和范围。
[0013]数值范围包括限定该范围的数值。除非另有说明，分别地，核酸是以5’到3’方向从左往右书写，氨基酸序列是以氨基到羧基方向从左往右书写。
[0014]除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton,等人，DICT1NARY OF MICROB1LOGY ANDMOLECULAR B1LOGY,第2版，John Wiley and Sons, New York(1994),和Hale&Markham, THEHARPER COLLINS DICT1NARY OF B1LOGY, Harper Perennial, N.Y.(1991)向技术人员提供了许多本文所用术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和容易参考，下文对某些术语进行定义。
[0015]必须注意:当在本文和所附权利要求中使用时，除非上下文明确指出相反情况，否则不使用数量词时涵盖复数的指代物。例如，术语“引物”指一个/种或多个/种引物，即单个/种引物和多个/种引物。还应注意:权利要求可撰写成排除任何任选元素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求元素的引述相联系的这些排他性术语如“仅仅”、“仅”等或使用“否定性”限制的在先基础。
[0016]本文所使用的术语“样品”指的是含有一种或多种目的分析物的材料或材料混合物，其典型地但并非必须地为液体形式。在一个实施方式中，以最广义使用的该术语指含DNA或RNA的任何植物、动物或病毒材料，例如来自体外细胞培养成分或分离自个体的组织或流体(包括但不限于血浆、血清、脑脊液、淋巴、眼泪、唾液和组织切片)，以及来自环境的样品。术语“样品”还指“生物样品”。本文所使用的术语“生物样品”指的是整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集(例如，体液，包括但不限于血液、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液)。“生物样品”还指从整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集，或其级分或部分制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于，例如血浆，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的的外部切片，眼泪、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官。最经常地，已从动物移除样品，但术语“生物样品”还可以指在体内被分析的细胞或组织，即不从动物中移除。典型地，“生物样品”将含有来自动物的细胞，但该术语还可以指非细胞生物材料，例如血液、唾液或尿的非细胞级分，其可被用于测量癌症相关多核苷酸或多肽水平。“生物样品”还指含有细胞组分(例如蛋白质或核酸分子)的生物体已在其中繁殖的基质，例如营养培养液或凝胶。
[0017]本文所使用的术语“核酸样品”表示含核酸的样品。本文使用的核酸样品可以是复合物，因它们包含多种不同的含序列分子。来自哺乳动物(例如小鼠或人类)的基因组DNA是复合样品的类型。复合样品可具有多于104、15UO6或10 7种不同核酸分子。DNA靶标可源自任何来源例如基因组DNA或人工DNA构建体。本文中可以使用任何含核酸的样品，例如由组织培养细胞或组织样品制得的基因组DNA。
[0018]本文所使用的术语“混合物”指的是散布且无任何特定顺序的要素的组合。混合物是异质的且不可在空间上分离成其不同组分。要素混合物的实例包括大量不同的溶解于相同水性溶液的要素，和大量不同的在随机位置(即，不以特定顺序)附着到固体支持物的要素。混合物是无法寻址的。例如，如本领域中通常已知的，空间上分离的表面结合多核苷酸的阵列不是表面结合多核苷酸的混合物，因为表面结合多核苷酸的种类在空间上不同且所述阵列是可寻址(addressable)的。
[0019]术语“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基以及含有已被修饰的其它杂环碱基的部分(moiety)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或啼啶，酰基化的嘌呤或啼啶，烷基化的核糖或其它杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记以及可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，也可以包含其它糖的部分。经修饰的核苷或核苷酸也包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。
[0020]术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，其用于描述任意长度的聚合物，例如，多于约2个碱基，多于约10个碱基，多于约100个碱基，多于约500个碱基，多于1000个碱基，高达约10，000个或更多碱基构成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可酶促地或合成地生产(例如，如美国专利号5，948，902和其中所引用的参考文献中所述的PM)，其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖骨架，但PNA的骨架由通过肽键相连的重复N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元构成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。锁核酸(LNA)(通常被称为无法接近的RNA)是经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。所述桥“封锁”了 3’-内(北(North))构象的核糖，这通常发现于A-型双链体(duplex)中。只要期望，可将LNA核苷酸与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合。术语“非结构化核酸”或“UNA”是含有相互之间结合的稳定性较低非天然核苷酸的核酸。例如，非结构化核酸可含有G’残基和C’残基，其中这些残基分别对应于G和C的非天然存在形式(即类似物)，它们稳定性较低地相互碱基配对，但保留与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。US20050233340中描述了非结构化核酸，其中关于UNA的公开内容通过引用被并入本文。
[0021]本文所使用的术语“靶多核苷酸”指的是被研宄的目的多核苷酸。在某些实施方式中，靶多核苷酸含有一种或多种被研宄的目的序列。
[0022]本文所使用的术语“寡核苷酸”表示长度为约2-200个核苷酸，直至500个核苷酸的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的或者可通过酶法制成，在一些实施方式中，其长度为30-150个核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、61-70,71-80,80-100,100-150 或 150-200 个核苷酸。
[0023]本文所使用的术语“引物”指在纯化的限制消化物中天然存在的或者通过合成产生的寡核苷酸，当被放置在与核酸链互补的引物延伸产物的合成被诱导的条件下时，即存在核苷酸和诱导剂(例如DNA聚合酶)且处于合适的温度和pH时，其能够担当合成起始点。引物可以是单链的或双链的，但必须足够长以在诱导剂存在时启动期望延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物典型地含有15-25个或更多核苷酸，但它也可含有更少核苷酸。本文的引物被选择为与特定靶DNA序列的不同链基本上互补。这意味着:引物必需足够互补以与它们各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可被连接到引物的5’末端，而引物序列的其余部分与链互补。或者，非互补碱基或更长序列可散布在引物中，条件是:引物序列与链序列足够互补以与其杂交并从而形成合成延伸产物的模板。
[0024]术语“杂交”指的是下述过程，其中核酸链在正常杂交条件下与第二互补核酸链退火并形成稳定双链体(同源双链体或异源双链体)，且在