重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的纯化的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重组人半乳糖脑苷脂-半乳糖苷酶的纯化方法和通过此方法得到 的产物。
【背景技术】
[0002] 半乳糖脑苷脂-半乳糖苷酶是一种能催化半乳糖脑苷脂的半乳糖水解的酶。 它的缺乏可以导致组织中半乳糖脑苷脂的蓄积。已经有研宄表明，可以从天然标本中，如 肝（Ben-Yoseph,ArchivesofBiochemistryandBiophysics, 1979)、淋巴细胞（Sakaiet al,J.Biochem.，1994)和尿（Sakaietal,J.Biochem.，1994)，进行人GALC的部分纯化。由 于GALC的极端的疏水性和低丰度，所以已知的这些纯化方法很复杂。回收率非常低，只能 获得全长GALC(80kDa)和加工片段（主要50和30kDa)的混合物。此外，先前的研宄只是 针对酶的特性而不是为了人体酶替代疗法（ERT)而进行大规模生产。
[0003] 因此，产生在适用于人体的生理溶液中具有高纯度的均匀产品（80kDarhGALC)的 改进的rhGALC纯化方法是有利的。
【发明内容】
[0004] 开发了一种纯化重组人半乳糖脑苷脂-0-半乳糖苷酶（rhGALC)的方法，其产生 满足动物/人类研宄对质量和纯度的要求的终产物。所述方法包括三个主要的色谱步骤和 一个可选的UFDF制剂步骤。在此研宄中，从20升补料分批生物反应器中得到的新鲜和澄 清的收获物用最优化的方法纯化来产生用于动物/人类研宄的rhGALC。
[0005] 所述纯化方法基于包括不同作用模式的捕获、中度纯化（intermediate)和精制 色谱步骤的三步法。优选地，所有步骤都以结合模式进行，并在洗脱前包括洗涤步骤。在一 个具体实施方案中：捕获步骤是用Capto?Blue,，中度纯化步骤是用Capto?Adhere，精制 步骤是用ToyopearlEther。所述方法的实施方案包括两个专用的病毒失活/去除步骤。 可由UFDF制备产物池，然后无菌过滤成最终产物。
[0006] 最终目的是生产rhGALC作为酶替代疗法用于治疗溶酶体酶贮积病球形细胞脑白 质营养不良（Krabbe氏病）。Krabbe病是由酶GALC遗传缺陷引起的。GALC缺乏导致鞘脂 类代谢产物半乳糖基鞘氨醇（鞘氨醇半乳糖苷）的逐渐累积、脱髓鞘和过早死亡。
[0007] 因此，本发明的目的是提供一种纯化rhGALC的方法。特别地，本发明的目的是提 供一种纯化rhGALC的方法，其在动物和人类中可用地解决上述问题。
[0008] 因此，本发明的一个方面涉及一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖脑苷 脂-0 -半乳糖苷酶（rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在树脂 上进行色谱法，所述方法包括：
[0009] a)捕获步骤：其中将所述rhGALC在第一多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离 子分尚进行病毒灭活和/或纯化；
[0010] b)中度纯化步骤：其中所述rhGALC在第二多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过 离子分离进行病毒灭活和/或纯化；
[0011] C)精制步骤：其中所述rhGALC在色谱树脂上纯化，所述树脂选自多峰色谱树脂、 阴离子交换树脂和疏水相互作用色谱（HIC)树脂。
[0012] 在具体的实施方案中，本发明还提供一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖 脑苷脂（rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在树脂上进行色谱 法，所述方法包括：
[0013] a)提供所述细胞培养物的包含rhGALC的级分；
[0014] b)将所述细胞培养物的级分装载到包含静电配体的第一多峰色谱树脂上；
[0015] c)将rhGALC从第一多峰色谱树脂上洗脱到包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇 (V/V)的第一洗脱缓冲液中；d)将所述第一洗脱液装载到含阴离子和疏水配体的第二多峰 色谱树脂上；
[0016] e)将rhGALC从第二多峰色谱树脂上洗脱到pH低于5. 5、包含至少30%的丙二醇 和/或乙二醇（体积/体积）第二洗脱缓冲液中；
[0017]f)将所述第二洗脱液装载到有疏水性配体的第三多峰色谱树脂上；和
[0018] g)将rhGALC从所述第三多峰色谱树脂上洗脱到水性缓冲液中，藉此得到第三洗 脱液。
[0019] 本发明的另一个方面涉及包含rhGALC的组合物。该组合合物可通过本发明的纯 化方法得到。
[0020] 本发明的又一个方面是提供用作药物的本发明组合物。
[0021] 本发明的又一个方面是提供用于治疗球形细胞脑白质营养不良（Krabbe氏病）的 本发明组合物。
[0022] 在本发明的又一个方面，本发明涉及治疗球形细胞脑白质营养不良（克拉伯病） 和/或减少或减轻与球形细胞脑白质营养不良（克拉伯病）相关的症状的方法，所述方法 包括将包含本发明的纯化rhGALC的组合物给予有需要的受试者的步骤。
【附图说明】
[0023] 图 1
[0024] 图1示出所述纯化rhGALC的方法的概要。将20升生物反应器的收获物通过三 个试验规模的色谱周期进行纯化。将Ether产物汇集，所述方法继续一个周期得到终产物 TG1106〇
[0025]图 2
[0026] 图2示出了三个色谱周期以及UFDF和过滤周期中每个步骤的产率（％活性）。右 边显示从澄清收获物到终产物的总收率。活性通过至少两次稀释一式两份进行测定，除了 Ether步骤的产物在一次实验中测定。
[0027]图 3
[0028] 图3示出从澄清的收获物到终产物的总剩余活性的的概况。活性测量同图2。
[0029]图 4
[0030] 图4显示终产物TG1106和内部标准StG02、StG03的Westernblot分析。GALC用 针对StG02产生的的兔多克隆抗体进行检测。
[0031] 图 5
[0032] 图5示出Ether产物、UFDF产物和终产物TGI106以及内部标准StGO的Western blot分析3。GALC用针对StG02产生的兔多克隆抗体进行检测。
[0033] 图 6
[0034] 图6示出TG11063-10和内部标准StG03在pH3-10凝胶上的等电点聚焦。
[0035]图 7
[0036] 图7示出终产物TG1106和下游处理样品的胶体蓝染色的SDS-PAGE。
[0037]图 8 和 9
[0038] 图8和9示出各种浓度的终产物TG1106和StG03的胶体蓝染色的SDS-PAGE。
[0039] 图 10
[0040] 图10示出终产物TG1106和内部标准StG03的胶体蓝染色的NativePAGE(4_16% Bis-Tris，G250 电荷转移，PH7. 0)。
[0041] 下面更加详细地说明本发明。
【具体实施方式】
[0042] 方法
[0043] 本发明的一个方面涉及到一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖脑苷 脂-0 -半乳糖苷酶（rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在树脂 上进行色谱法，所述方法包括：
[0044] a)捕获步骤：其中所述rhGALC在第一多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离子 分离进行病毒灭活和/或纯化
[0045] b)中度纯化步骤：其中所述rhGALC在第二多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过 离子分离进行病毒灭活和/或纯化。
[0046] c)精制步骤：其中所述rhGALC在色谱树脂上纯化，所述树脂选自多峰色谱树脂、 阴离子交换树脂和疏水相互作用色谱（HIC)树脂。
[0047] 根据本发明的一些实施方案中，所述中度纯化步骤包括在所述第二多峰色谱树脂 上纯化所述rhGALC，随后在选自以下的色谱树脂上纯化所述rhGALC:
[0048]i)不同于所述第一和第二多峰色谱树脂的多峰色谱树脂；和
[0049] ii)疏水相互作用色谱（HIC)树脂。
[0050] 根据本发明的其他实施方案，所述第一和第二多峰色谱树脂是不同的树脂。
[0051 ] 特别地，所述第一多峰色谱树脂可以包括静电配体。
[0052] 根据本发明的其它实施方案，所述第二多峰色谱树脂包括阴离子和疏水配体。
[0053] 在另一些实施方案中，所述精制步骤中的色谱树脂是具有疏水性配体的树脂。
[0054] 所述第一多峰色谱树脂可特别包含式如下所述的（VI)的配体化合物。
[0055] 所述第二多峰色谱树脂可特别包含如下所述的式（VIII)的配体化合物。
[0056] 根据其他实施方案，所述第一多峰色谱树脂特别包含如下所述的式（VI)化合物 作为配体。并且所述第二多峰色谱树脂特别包含如下所述的式（VIII)化合物作为配体。根 据这些实施方案，优选的是所述rhGALC随后在树脂上纯化，所述树脂为醚树脂。合适的醚 树脂的实例在下面给出。
[0057] 根据本发明的一些实施方案中，将所述rhGALC从所述第一多峰色谱树脂上洗脱 到包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇（V/V)的第一洗脱缓冲液中；
[0058] 在本发明的其它实施方案中，将所述rhGALC从所述第二多峰色谱树脂上洗脱到 pH低于5. 5、包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇（v/v)的第二洗脱缓冲液中。
[0059] 根据本发明，所述纯化重组人半乳糖脑苷脂（rhGALC)的方法可特别地包括：
[0060] a)提供所述细胞培养物的包含rhGALC的级分；
[0061]b)将所述细胞培养物的级分装载到包含精典配体的第一多峰色谱树脂上；
[0062] c)将rhGALC从所述第一多峰树脂上洗脱到包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇 (V/V)的第一洗脱缓冲液中，藉此得到第一洗脱液；
[0063] d)将所述第一洗脱液装载到所述包含阴离子和疏水配体的第二多峰色谱树脂 上；
[0064] e)将rhGALC从所述第二多峰树脂上洗脱到pH低于5. 5、包含至少30%的丙二醇 和/或乙二醇（体积/体积）的第二洗脱缓冲液中，藉此得到第二洗脱液；
[0065]f)将所述第二洗脱液装载到具有疏水性配体的第二多峰色谱树脂上；和
[0066]g)将rhGALC从所述第三多峰色谱树脂上洗脱到水性缓冲液中，藉此得到第三洗 脱液。
[0067] 人半乳糖脑苷脂-0-半乳糖苷酶（rhGALC)有几个同义词存在。最常用的是半乳 糖脑苷脂酶，半乳糖（基）神经酰胺酶，人半乳糖脑苷脂酶，半乳糖神经酰胺半乳糖苷 酶（EC3. 2. 1. 46)。蛋白质登录号是NP_000144. 2和P45803。应理解本发明的rhGALC可包 含标签。
[0068] 根据本发明的实施方案，术语人半乳糖脑苷脂_半乳糖苷酶还包括功能相同 的区域或全长氨基酸序列的类似物。
[0069] 了解rhGALC的某些特性，对建立纯化rhGALC或功能相同的区域或全长氨基酸序 列的类似物的