一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及紫杉醇的提取方法，具体地说，涉及一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法。
【背景技术】
[0002]紫杉醇(taxol)最早由Wani等分离自短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt)，是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类化合物用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、食道癌等。SchifT证实了紫杉醇作用机理是通过与微管蛋白结合，促进其聚合，抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细胞的无限增殖。
[0003]目前，主要从红豆杉的树皮中提取紫杉醇。由于红豆杉系珍稀植物，而树皮中紫杉醇含量很低，靠树皮提取紫杉醇无法满足市场需求，且严重地破坏自然资源，危及生态平。1993年，Stierle等从短叶红豆杉的韧皮部中分离出一种紫杉醇产生菌，开拓了一条通过微生物发酵生产紫杉醇的新途径。1996年，Strobel等从西藏红豆杉中分离到一株产紫杉醇的内生真菌，产量达到50ug/L ;2000年，Wang等从南方红豆杉中分离出一株产紫杉醇内生真菌，产量达185.4ug/L;周东坡等从东北红豆杉一株内生真菌，是我国的新记录属-树状多节孢，产量为51.06-125.70ug/L?近几年来，国内外学者们通过对紫杉醇高产菌的筛选以及对发酵条件的优化方面做了研宄。Govindarajan Kathiravan等对短毛拟盘多毛孢进行发酵，检测到紫杉醇含量为640ug/L ;耿直等从秦巴山区中国红豆杉茎和根中分离出一株绿僵菌经发酵后产量可达846.lug/L ;张远都等从南方红豆杉韧皮部筛选出一株链格孢属的新种，其培养液中紫杉醇含量为1003ug/L，基本达到工业生产要求；耿直靳瑞等筛选到一株产紫杉醇的内生真菌XC1-07进行发酵条件的初步优化，使紫杉醇的产量为1124.34ug/Lo我们从患皮肤病的大熊猫患病处分离出一株紫杉醇产生菌，经鉴定为拟盘多毛孢属。同时通过TLC、UV、HPLC, NMR多种检测手段证实其产紫杉醇的能力。
[0004]2011，从位于雅安的中国大熊猫保护和研宄中心的大熊猫皮肩中，分离出一株海南拟盘多毛孢。海南拟盘多毛孢一般是一种从罗汉松等植物中分离出来的内生真菌。据我们了解，这是在动物中发现海南拟盘多毛孢的第一次报告，而所有其他的拟盘多毛孢物种，均是从红豆杉植物中分离的。虽然从非动物来源中分离出紫杉醇的量仍然很低，但是从动物来源中分离出的海南拟盘多毛孢产紫杉醇的量，是否高于非动物资源的水平仍然未知。非动物来源真菌产紫杉醇产量低，而大熊猫源海南拟盘多毛孢紫杉醇产量很少有报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法，该方法调查了从大熊猫皮肩中分离出的海南拟盘多毛孢生产紫杉醇的产量。其具体技术方案为:
[0006]一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法，包括以下步骤:
[0007]步骤1:菌体的培养及发酵
[0008]将分离自大熊猫体表的海南拟盘多毛孢菌株接种到PDA固体培养基上，28°C避光培养，镜检产孢后，用20ml无菌生理盐水冲洗菌落制成混悬液，将混悬液移入一无菌试管，密闭放入涡流器15s，使菌悬液充分混匀；
[0009]然后用移液器将制备好的菌悬液转入CPDA发酵液，用震荡培养箱，28 °C、200r/min恒温震荡培养21?28天；
[0010]步骤2:次级代谢产物的提取
[0011]CPDA发酵液4°C，10000r/min，离心lOmin，分别收集上清液和菌丝体。加入0.5gNaC03到上清液中，同时可加入NaCl，用等体积的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌丝体加入甲醇搅拌均匀，用超声破碎仪破碎细胞后冷冻24h，经离心得有机相和菌丝体，菌丝体再进行索氏提取8h，溶剂为二氯甲烷，然后合并上述三部分有机相于旋转蒸发仪上35°C旋转浓缩成浸膏状，浸膏溶于1ml甲醇用于柱层析；
[0012]步骤3:柱层析纯化
[0013]AB-8大孔树脂进行预处理后，湿法装柱。用无水乙醇以1.0ml/min的流速冲柱稳定后，用浓度为30 %、40 %、50 %、60 %、70 %的乙醇溶液进行洗脱，流速为1.5ml/min，收集洗脱液，进行TLC检测，展层体系，在254nm紫外灯下观察荧光，再用1%香草醛的浓硫酸喷雾显色，观察有无紫杉作对照，收集上述具有特征性蓝斑的洗脱液，经浓缩后再重复过柱两次得到纯化后的样品。
[0014]进一步，步骤I中所述菌悬液和发酵液的体积比为1: 100。
[0015]进一步，步骤2中所述菌丝重量:甲醇体积=Ig: 10ml。
[0016]进一步，步骤3中展层体系为二氯甲烷和甲醇，其体积比为20: I。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0018]本发明方法所提取的海南拟盘多毛孢真菌产的紫杉醇，和标准紫杉醇有相同的结构，且产量为1466.87 μ g/Lo大熊猫皮肩中的这种真菌，产紫杉醇的量显著高于来自非动物来源的真菌。真菌生产紫杉醇可能是一个为紫杉醇工业规模化生产的潜在候选方法。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0020]本发明方法中的菌株
[0021]分离自大熊猫体表的海南拟盘多毛孢菌株。海南拟盘多毛孢菌(大熊猫源)采集于中国四川省雅安市碧峰峡镇中国保护大熊猫研宄基地。
[0022]培养基及发酵液
[0023]PDA 固体培养基；CPDA 发酵液:200g 马铃薯，20g 葡萄糖，3g KH2P04，1.5gMgS04，0.15g柠檬酸三钠(实验中用柠檬酸三钠代替柠檬酸)，0.0lg VBLlOOOmL自来水，pH6.5。
[0024]实施例1
[0025]一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法，包括以下步骤:
[0026]步骤1:菌体的培养及发酵
[0027]将分离自大熊猫体表的海南拟盘多毛孢菌株接种到PDA固体培养基上，28°C避光培养，镜检产孢后，用20ml无菌生理盐水冲洗菌落制成混悬液，将混悬液移入一无菌试管，密闭放入涡流器15s，使菌悬液充分混匀；
[0028]然后用移液器将制备好的菌悬液转入CPDA发酵液(按菌悬液:发酵液=I: 100)，用震荡培养箱，28°C、200r/min恒温震荡培养21天；
[0029]步骤2:次级代谢产物的提取
[0030]CPDA发酵液4°C，10000r/min，离心1min，分别收集上清液和菌丝体。加入0.5gNaC03(1000ml的量)到上清液中，同时可加入NaCl，用等体积的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌丝体加入甲醇(按菌丝重量:甲醇体积=1:1Og:ml)搅拌均勾，用超声破碎仪破碎细胞后冷冻24h，经离心得有机相和菌丝体，菌丝体再进行索氏提取8h，溶剂为二氯甲烷，然后合并上述三部分有机相于旋转蒸发仪上35°C旋转浓缩成浸膏状，浸膏溶于1ml甲醇用于柱层析；
[0031]步骤3:柱层析纯化
[0032]AB-8大孔树脂进行预处理后，湿法装柱。用无水乙醇以1.0ml/min的流速冲柱稳定后，用浓度为30%的乙醇溶液进行洗脱，流速为1.5ml/min，收集洗脱液，进行TLC检测，展层体系(二氯甲烷:甲醇=20: 1)，在254nm紫外灯下观察荧光，再用1%香草醛的浓硫酸喷雾显色，观察有无紫杉作对照，收集上述具有特征性蓝斑的洗脱液，经浓缩后再重复过柱两次得到纯化后的样品。
[0033]实施例2
[0034]一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法，包括以下步骤:
[0035]步骤1:菌体的培养及发酵
[0036]将分离自大熊猫体表的海南拟盘多毛孢菌株接种到PDA固体培养基上，28°C避光培养，镜检产孢后，用20ml无菌生理盐水冲洗菌落制成混悬液，将混悬液移入一无菌试管，密闭放入涡流器15s，使菌悬液充分混匀；
[0037]然后用移液器将制备好的菌悬液转入CPDA发酵液(按菌悬液:发酵液=I: 100)，用震荡培养箱，28°C、200r/min恒温震荡培养25天；
[0038]步骤2:次级代谢产物的提取
[0039]CPDA发酵液4°C，10000r/min，离心1min，分别收集上清液和菌丝体。加入0.5gNaC03(1000ml的量)到上清液中，同时可加入NaCl，用等体积的乙酸乙酯:丙酮萃取三次，每次4h，向菌丝体加入甲醇(按菌丝重量:甲醇体积=1:1Og:ml)搅拌均勾，用超声破碎仪破碎细胞后冷冻24h，经离心得有机相和菌丝体，菌丝体再进行索氏提取8h，溶剂为二氯甲烷，然后合并上述三部分有机相于旋转蒸发仪上35°C旋转浓缩成浸膏状，浸膏溶于1ml甲醇用于柱层析；
[0040]步骤3:柱层析纯化
[0041]AB-8大孔树脂进行预处理后，湿法装柱。用无水乙醇以1.0ml/min的流速冲柱稳定后，用浓度为40%