一种cpc酰化酶重组表达系统的构建与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达CPC酰化酶表达系统的构建及其应 用。
【背景技术】
[0002] 头孢菌素类药物（Cephalosporins)是一族广谱半合成抗生素，它与青霉素类抗 生素一样，分子结构中都具有内酰胺环，故统称为内酰胺类抗生素，都是以破坏细 菌细胞壁合成为机制的抗生素。近年来，由于其过敏反应小、对酸和内酰胺酶较稳定， 且与其他抗生素无交叉耐药性，在抗生素工业日益收到研宄人员的重视。
[0003] 头孢菌素类抗生素结构均为由母核和侧链构成，其母核7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)，是头孢菌素的抗菌部位，是各类半合成头孢菌素类抗生素药物的重要中间体。 7-ACA的研宄和生产显得至关重要。目前获得7-ACA有三种方法：化学裂解法、两步酶法 和一步酶法。化学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，而且涉及 到大量有毒有害的有机溶剂，因此环境友好的酶法越来越受到重视。酶法裂解主要包括两 步酶法和一步酶法，两步酶法即通过D-氨基酸氧化酶（DAA0)、戊二酰-7-氨基头孢烷酸 (glutaryl7_aminocephalosporanic acid，GL-7-ACA)酰化酶两步酶法实现酶法 7-ACA 的 工业化制备，但存在氧化条件控制难度大、两步酶法生产工艺复杂、成本较高的缺点。研宄 人员尝试了分别提高两种酶的酶活并将二者融合表达，并加入H 202酶消除反映过程中产生 的H202对酶活的影响，但效果并不显著。一步酶切法是通过CPC酰化酶将CPC直接转化为 7-ACA。为缩短工艺流程，降低7-ACA生产成本，提高国际竞争力，各国科学家一直致力于一 步酶法工艺的研宄。在未来的几十年里，应用一步酶法直接酰化CPC获得7-ACA将具有广 阔的发展前景。利用克隆重组技术，可以提高CPC酰化酶的表达量，对其进一步工业化应用 具有重要意义。
[0004] 头孢菌素酰化酶（Cephalosporin acylase，CA)是一类催化头孢菌素C (CPC)或 GL-7-ACA酰基侧链脱酰基生成7-ACA的酶。根据催化底物的不同，可以将头孢菌素酰化酶 分为CPC酰化酶（acy II基因产物）和GL-7-ACA酰化酶（acy I基因产物）。
[0005] 目前产头孢菌素酰化酶的菌株有假单胞菌Pseudomonas sp. A14，Pseudomonassp. SY-77-1， Pseudomonas sp.C130， Pseudomonas sp.SE83， Pseudomonas sp.N176? Pseudomonas sp.C427，Pseudomonas sp.V22? Pseudomonas sp. BL072? Pseudomonas sp.CCRC11041、Flavobacterium、bacillus 和小型丝状真菌 Aoryzae，Aspergillus nidulan， Penicillium oxalicum， Schizomycetes， Paecilomyces puntonii C2106， Fusarium。111111〇1'11111等。其中已经克隆的基因有来自 Pseudomonas sp. N176和 Pseudomonas sp. SE83的CPC酰化酶基因。这2株菌都能产种头孢菌素酰化酶，不仅可以催化GL-7-ACA 为7-ACA，也可以直接催化CPC为7-ACA。但是原菌CPC酰化酶对CPC的活性是对GL-7-ACA 活性的2%~4%。
[0006]目前基因工程技术被认为是提高酶产量和活力最有竞争力的技术。由于野生菌株 对CPC活性较低，不能满足工业生产的需求，所以国内外学者采用基因工程技术对CPC酰化 酶基因进行人工改造和化学合成表达。以降低其对GL-7-ACA活力，提高其对CPC活力。大 肠杆菌作为应用最为广泛的基因工程菌，有遗传背景清楚、培养周期短等优点。因此研宄 人员普遍采用大肠杆菌作为表达宿主，表达CPC酰化酶。最早在1996年Saito等克隆了 来自Pseudomonas diminuta N176中的CPC酰化酶的基因，并在大肠杆菌中分别进行了表 达。并进一步定点突变，突变体对GL-7-ACA的活力都有所下降，对CPC活力升高，其中突变 酶M164L对CPC的催化能力提高了 22 %，而M269Y和M269F的突变使得其对CPC的比活提 高了 1. 5倍和1. 7倍。基于Pseudomonas sp. SE83Acy II CPC酰化酶活性中心的构象对其 活性位点的残基进行改造，以使其原本适应于GL-7-ACA侧链的活性中心能更适应CPC的侧 链，通过多点联合突变使该酶的CPC催化活性得到大幅提高，Q50 M/Y149 a K/F177 G突 变体的酶活提高为野生型的790%。同年Asai对CPC酰化酶N176突变酶的纯化进行了研 宄，可以通过加入离子表面活性剂的方法去除CPC酰化酶中的酯酶，从而达到纯化CPC酰化 酶提高其酶活的目的。通过对源于Pseudomonas diminuta N176的CPC酰化酶进行定向进 化并结合易错PCR诱变，使A215Y-H296S-H309S突变体的CPC/GL-7-ACA催化效率提高了约 100倍，显著提高其对CPC活性，使CPC转化率达到90%，即获得了一种真正意义上的CPC酰 化酶。为酶法制备7-ACA的工业上的应用打下基础。2008年，有研宄人员以Pseudomonas sp. SE83中的CPC酰化酶的氨基酸序列作为模板，在诱导型表达系统中表达经过优化的CPC 酰化酶基因。并控制培养条件，通过降低发酵温度或是添加诱导剂来减少包涵体的形成，提 高外援蛋白的表达量。还有人运用基因敲出技术，把大肠杆菌宿主基因组中的内酰胺 酶和乙酰酯酶的基因进行了敲除消除重组菌中这两种杂酶的影响。防止酶催化过程中副产 物的生成，简化了酶的纯化操作，提高了 7-ACA产品的质量。还有报道称对具有组氨酸标签 的重组CPC酰化酶进行了纯化研宄，采用以Cu2+-IDA为配基的固定化金属离子亲和层析柱 制备得到了高纯度的CPC酰化酶，纯化后的CPC酰化酶的比酶活为10U/mg，是纯化前的2. 5 倍。
[0007] 为了进一步提高CPC酰化酶的活性，本发明人根据GenBank中Pseudomonas sp. SE83cephalosporin acylase的蛋白质序列（登录号AAA25690)，通过密码子翻译获得 基因序列。通过基因工程的方法来提高酶的稳定性和活性，构建分泌型基因工程菌来简化 酶的分离纯化操作，优化酶反应的催化过程，将会是今后一段时间头孢菌素酰化酶法生产 7-ACA的发展方向。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种经密码子优化的CPC酰化酶基因，所述CPC酰化酶 基因的核苷酸序列为选自SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 3、SEQ ID N0. 4、SEQ ID N0. 6所示的 核苷酸序列；发明同时还公开了由所述核苷酸序列翻译获得的氨基酸序列。
[0009] 进一步地，本发明还提供了含有所述CPC酰化酶基因的重组质粒和宿主菌，其中 所述重组质粒具有如图1所示的结构，所述宿主菌为选自大肠杆菌BL21(DE3)和ROSETTA。
[0010] 本发明的另一个目的是提供所述的CPC酰化酶基因在制备转基因大肠杆菌中的 应用以及含有所述CPC酰化酶基因的转基因大肠杆菌的制备方法，其中所述制备方法包括 以下步骤：
[0011] (1)合成并扩增CPC酰化酶基因，其中所述CPC酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6 所示；
[0012] (2)将CPC酰化酶基因与载体可操作地连接，构建CPC酰化酶的达载体并转化到宿 主中，其中所述宿主为选自大肠杆菌BL21(DE3)和ROSETTA ;
[0013] (3)培养宿主和诱导CPC酰化酶表述，获得表达CPC酰化酶基因的转基因大肠杆 菌。
[0014] 本发明的又一个目的是提供所述的CPC酰化酶基因在制备头孢菌素类药物中的 应用。
[0015] 本发明的再一个目的是提供培养基所述宿主菌的优化培养基，包括以下成分：甘 油11. 49-12. 49g/L，酵母提取物26. 33-27. 33g/L，牛肉膏14. 73-15. 73g/L。优选包括以下 成分：甘油11. 99g/L，酵母提取物26. 83g/L，牛肉膏15. 23g/L。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明所述质粒PET-28a_CPC的结构示意图；
[0017] 其中，所述CPC为选自S1、S3、S4、S6基因。
[0018] 图2是蛋白质SDS-PAGE电泳图；
[0019] 四种表达载体分别表达SI、S2序列，其中M为marker，Prestained