一种高通量快速提取蔬菜单粒种子dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及模板DNA的制备方法，是一种高效、快速、 低成本、操作简便的高通量蔬菜单粒种子DNA提取方法。
【背景技术】
[0002] 分子生物学技术已经渗透到生物学、医学、植物学、遗传学和动物学等各个方面。 植物DNA的提取是进行分子分析的最基本步骤，在植物基因工程以及植物分子生物学研究 中占有重要地位，所提取出的DNA质量的好坏将直接关系到后期分子生物学试验研究的成 败。基于PCR技术的分子标记已广泛地运用于种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅 助育种、基因定位以及转基因植株检测等。其中以PCR技术为基础的标记如简单重复序列 标记（SSR标记或微卫星标记），由于其具有多态性好、可靠性高、技术简单、价格便宜和DNA 模板使用量低等优点，在分子生物学中得到了广泛的应用。长期以来，单粒种子样本中DNA 的提取一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。因此，许多学者一直在探索蔬菜单 粒种子DNA的高通量快速提取方法。
[0003] 目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多，主要有传统法、螯合树脂法、 磁珠法、免疫亲合法等。
[0004] (1)传统法通过CTAB (十六烷基三甲基溴化铵）或SDS (十二烷基硫酸钠）裂解细 胞，酚/氯仿等有机溶剂抽提蛋白，能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于从 含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA，获得的DNA纯度高，含量多。但比较费时，需 要5小时甚至更多，流程繁琐，同时样品需要4-5个EP管，容易造成混淆和污染，操作复杂。 而且提取过程中使用了大量的有机溶剂，有损实验人员的健康。
[0005] (2)磁珠法靠磁珠吸附、磁场分离提取DNA，适用于冰冻、陈旧组织，简单、快速整个 过程仅需不到2小时，利用磁场分离可以得到较纯的DNA，但产量比传统法获得的少，且成 本较高。
[0006] (3)免疫亲合法通过抗原抗体反应来提取DNA，适用于样本含量很少的标本，获得 的DNA纯度高，含量多。缺点是设备要求比较高，不易普及，而且抗DNA单克隆抗体制备是 关键步骤。
[0007] (4)螯合树脂法使用Chelex-100树脂来提取DNA，据报道该方法目前用于细菌、血 液及部分病毒核酸提取，操作简单、快速、且成本不高。同时避免使用酚氯仿等有机溶剂，对 操作人员没有损害。
[0008] Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的 亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂 具有更高的金属离子选择性和较强的结合力.能结合许多可能影响一步分析的其他外源 物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防 止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合 金属离子，防止DNA降解，并提高PCR扩增成功率。1989年Singer. Sam等最先报导了用 Chelex-100法提取组织培养细胞DNA，1991年Walsh等系统的研究了该方法在多种法医生 物检材中的具体应用。目前Chelex-100法已经逐渐扩展到其他学科，用此法提取的DNA操 作简便，并可以减少提取过程中DNA的损失，常用于十分微量的样品中（如毛发、血液、精斑 和上皮脱落细胞中等）中提取足量的DNA。本发明利用Chelex-100对单粒种子破壳发育至 初期幼苗的新鲜单株样品进行高通量快速提取，提高了育种产业品种选育和纯度鉴定过程 的检测效率。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服传统样本DNA提取步骤多、复杂、费时等缺点，公开了一种 高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法。本发明的DNA提取方法具有高效、快速、低成本、 操作简便等优势。
[0010] 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0011] 一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
[0012] (1)取待测植物样本l〇〇mg加入1. 5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨 至粉末；
[0013] (2)加入100 ii L10%Chelex_100溶液，涡旋充分混匀，置于65°C水浴锅中恒温水浴 20min；
[0014] (3)水浴后迅速冰上冷冻lOmin，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后 续PCR扩增。
[0015] 本发明所述的待测样本为植物样品包括花椰菜、大白菜、黄瓜、芹菜等各类蔬菜植 物样品。本发明所述的待测样本为植物种子破壳发育至初期幼苗的新鲜单株样品。
[0016] 本发明所述的Chelex-100溶液浓度为10%，加入量为100 i! L ;恒温水浴温度为 65°C，时间为20min ;离心速度为13200rpm/min，时间为3min。
[0017] 为了能更加清楚的说明本发明的提取方法，下面以大白菜为样本实例，对本发明 的提取方法与传统的CTAB法分别加以比较对照说明。
[0018] 一、材料和方法
[0019] (1)样品：大白菜杂交种，由天津科润蔬菜研究所提供。
[0020] (2)主要仪器：高速冷冻离心机，PCR扩增仪，恒温水浴锅，凝胶电泳设备。
[0021] (3)主要试剂：
[0022] EST-PCR引物由上海生工公司合成，引物序列见表1。
[0023] 2 X GoTaq.li: Master Mixes 试剂购自 Promega 公司。
[0024] Chelex-100 购自 sigma 公司。
[0025] 10%Chelex_100溶液：称量 10g Chelex-100,加入90mL去离子水，121°C灭菌，用时 混匀。
[0026] CTAB (十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液：1000mL水中溶解CTAB20g， Trisl2. llg，NaC181. 82g，Na2EDTA7. 44g，高压灭菌。
[0027] 表1大白菜纯度鉴定EST-SSR引物序列
[0028]
[0029] 二、大白菜杂交种DNA的两种提取方法的比较
[0030] 1、CTAB 法提取 DNA
[0031] (1)取大白菜杂交种单株幼苗约l〇〇mg，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
[0032] (2)加入800 ii L预热至65°C的CTAB提取缓冲液，充分混合，65°C水浴60min，期间 不停颠倒混匀；
[0033] (3) 13200rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管，加入500 y L的氯仿异戊 醇，充分混匀，13200rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管；重复1次；
[0034] (4)加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温静置60min ;13200rpm/min离心 lOmin，弃上清；
[0035] (5)沉淀中加入350 y L氯化钠溶液溶解沉淀，再加入350 y L氯仿异戊醇，充分混 匀，13200rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管；
[0036] (6)加入0? 6倍体积异丙醇，混匀，13200rpm/min离心10min，弃上清；
[0037] (7)沉淀中加入500 y L70%乙醇溶液，13200rpm/min离心10min，弃上清；重复1 次；干燥沉淀，加入100 y L灭菌去离子水溶解DNA。
[0038]2、本发明方法提取DNA
[0039] (1)取大白菜杂交种单株幼苗约lOOmg加入1. 5mL灭菌离心管中，利用手持式电动 破碎仪研磨至粉末；
[0040] (2)加入100 ii L10%Chelex_100溶液，涡旋充分混匀，置于65°C水浴锅中恒温水浴 20min；
[0041] (3)水浴后迅速冰上冷冻lOmin，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后 续PCR扩增。
[0042] 三、两种方法提取DNA的PCR扩增检测试验：
[0043] 1、PCR反应体系组成：
[0044] 2X 〇〇丁叫? Master Mixes5 ii L，上游和下游引物 10μmol/L 各 0? 25 ii L，供试品 种大白菜基因组DNA模板，浓度50ng/ y L，1 y L，双蒸水补足10 y L ;
[0045] 2、PCR反应程序：
[0046] 94°C预变性 5min，35 个扩增循环（94°C lmin，53. 5°C 45sec，72°C 45sec) ;72°C延 伸7min，4°C保存；
[0047] 3、产物鉴定：8%非变性聚丙烯凝胶电泳
[0048] 电泳条件，电压：250V ;时间：30min。
[0049] 银染观察，用20bp Marker做分子量标记。
[0050] 4、PCR扩增结果：
[0051] 对两种方法提取的DNA，分别进行大白菜纯度鉴定引物BC1、BC9、BC26的扩增，非 变性聚丙烯凝胶电泳结果见附图。结果显示，两种方法提取DNA的扩增结果是基本一致的。
[0052] 本发明与传统技术相比具有的积极效果在于：
[0053] (1)传统DNA提取操作步骤多、复杂、费时。需要经过裂解、抽提等多个步骤，同时 需要在多个离心管之间相互转移样本，增加了对样本间交叉污染的可能性。另外，氯仿等有 机溶剂对人体有害。而本发明的DNA提取方法过程简便、整个提取过程在同一离心管中即 可完成，同时无需使用有毒有机溶剂，对人体和环境都不会造成危害。
[0054] (2)本方法最大的优点在于其过程快速，简便，充分提高了育种产业品种鉴定和纯 度鉴定的检测效率。与传统的提取过程需要5小时左右相比，采用本方法，35min就可以完 成样本DNA提取的全过程。
[0055] (3 )采用本发明的快速提取样本DNA的方法所得到的DNA经PCR检测实验，证实与 传统方法得到的DNA基本一致，完全可以采用此方法替代复杂、费时的传统CTAB法，从而大 大节省了时间。
【附图说明】：
[0056] 图1为EST-SSR引物BC1用于大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依 次为大白菜品种"秋绿75"、大白菜品种"津秋78"（传统CTAB法）；大白菜品种"秋绿75"、 大白菜品种"津秋78"（本发明方法）；
[0057] 图2为EST-SSR引物BC9用于大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依 次为大白菜品种"秋绿75"、大白菜品种"秋绿60"（传统CTAB法）；大白菜品种"秋绿75"、 大白菜品种"秋绿60"（本发明方法）；
[0058] 图3为EST-SSR引物BC26用于大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依 次为大白菜品种"秋绿75"、大白菜品种"津秋78"（传统CTAB法）；大白菜品种"秋绿75"、 大白菜品种"津秋78"（本发明方法）；
[0059] 图4为花椰菜EST-SSR引物HYC33扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为1-5 为本发明方法提取DNA的母本05H2扩增产物；6-25为本发明方法提取DNA的20株"津品 70" F1代杂交