一种鸡传染性支气管炎病毒ibv-k136、利用其制备的单克隆抗体细胞株3d5、单克隆抗体 ...的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一株鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136、 利用其制备的单克隆抗体细胞株3D5、单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB)是一种急性、高度传染 性的病毒性呼吸道疾病由鸡传染性支气管炎病毒引起。以病鸡咳嗽、气管啰音、打喷嚏为特 征，雏鸡最易感。尽管广泛使用传染性支气管炎弱毒疫苗和灭活疫苗，但由于该病血清型较 多，型与型之间的交叉保护较弱以及新型毒株的不断出现，导致其防治较困难，严重威胁了 我国养鸡业的发展。
[0003] 鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis virus，IBV)为冠状病毒科冠状 病毒属，其基因组为不分节段单股正链RNA，本身具有感染性。基因组全长27nt左右（不同 毒株略有不同），共编码3种结构蛋白，分别为纤突蛋白（S)、核衣壳蛋白（N)和膜蛋白（M)， 其中S基因是IBV抗原变异最主要的基因，在病毒血清学分类中起重要作用。N基因是IBV 的最保守的基因，在IBV鉴别诊断中起重要作用。
[0004] 针对IBV的检测方法目前主要有：病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验（ELISA)、PCR 检测、环介导等温扩增技术等方法。其中以间接ELISA和PCR检测方法较为快速准确。间 接ELISA方法具有检测成本低，灵敏度高，特异性好，适合大量样品等特点。但目前所建立 的ELISA方法主要针对IBV抗体，针对IBV抗原的检测方法极少，该技术瓶颈有待突破。而 要实现针对IBV抗原的检测方法，则需要性能优异的鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体作 为基础，相应的，就必须建立生产上述单抗的细胞株作，而能否构建适宜的细胞株又有赖于 有效的方法及病毒毒株的特性。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一株适用于感染生物后制备单克隆抗 体杂交瘤细胞株的鸡传染性支气管炎病毒，同时提供一种利用上述毒株制备的鸡传染性支 气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、该抗体以及该抗体的应用。
[0006] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis virus) IBV-K136,其保藏 编号为 CCTCC N0.V201320。
[0008] 上述一种鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136可以用于制备鸡传染性支气管炎病毒 抗体。
[0009] 上述一种鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136可以用于制备鸡传染性支气管炎病毒 单克隆抗体细胞株。
[0010] 利用上述一种鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136制备的一种鸡传染性支气管炎病 毒单克隆抗体细胞株3D5 (杂交瘤细胞株3D5)，其保藏编号为CCTCC C2014155。
[0011] -种鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体，上述细胞株3D5制备的。
[0012] 该单克隆抗体可以用于制备鸡传染性支气管炎病毒检测试剂盒或鸡传染性支气 管炎病毒检测试纸。
[0013] 优选的，所述试剂盒对鸡传染性支气管炎病毒的检测方法可以是ELISA法。
[0014] 优选的，所述试纸对鸡传染性支气管炎病毒的检测方法可以是胶体金法。
[0015] 在以上技术方案中，保藏编号为CCTCC NO. V201320和CCTCC C2014155两种生 物材料的保藏单位均为"中国典型培养物保藏中心"，其地址为"湖北省武汉市武昌区八一 路299号武汉大学校内"，其中CCTCC NO. V201320的保藏日期为2013年6月28日，CCTCC C2014155的保藏日期为2014年9月4日。
[0016] 在以上技术方案中，IBV-K136毒株为地方流行的肾型传染性支气管炎病毒毒株、 是通过筛选获得，以该毒株为抗原扩增后进行动物免疫，将免疫血清与骨髓瘤细胞融合筛 选出杂交瘤细胞，利用该方法筛选出性能优异的鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体细胞株 3D5,再对细胞株3D5进行培养以大量表达单克隆抗体。利用上述流程制备的单抗效价高、 抗原抗体反应速度快、特异性强，尤其适用于进一步制备鸡传染性支气管炎病毒抗原诊断 试剂盒，相应的检测方法可以是双抗夹心ELISA法或胶体金法等。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例中的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用到的 实验材料，若无特殊说明，均为自常规渠道（如普通生化试剂商店）购买得到。
[0018] 以下实施例中的生物材料来源如下：
[0019] IBV-K136株：2013年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号 为 CCTCC NO. V201320。
[0020] SPF鸡胚：购自山东省六一农场有限责任公司。
[0021] 鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒（M41株）、鸡传染性支气管炎病毒（Gray 株）、禽流感病毒亚型、鸡传染性法氏囊病毒、鸡减蛋综合征病毒和禽白血病病毒均购自 中国兽医药品监察所。
[0022] 实施例1 (单抗细胞株3D5的筛选以及单抗的制备）
[0023] 1.1抗原的制备
[0024] 将鸡传染性支气管炎病毒K136株接种于10日龄SPF鸡胚，6天后无菌收获鸡胚 尿囊液。将尿囊液差速离心具体方法如下：取-20°C冻存的病毒液融化后，5000g，4°C离心 30min，弃沉淀取上清液，再14000g，4°C离心20min，弃杂蛋白，取上清液。然后进行超速离 心：将上一步得到的上清液以66100g(TYPE60Ti，BeckmanL8-M)4°C离心1. 5h，弃上清，沉淀 加入 2mLTEN 缓冲液（50mM Tris-HCL、50mM NaCL、5mM Na2EDTA、PH7. 4)，并在无菌条件下降 沉淀吹打使其分散、溶解。放入_70°C冰箱备用。
[0025] 取少量浓缩后的病毒蛋白进行不同程度稀释，用紫外分光光度计测定病毒的0D26(i 和〇〇28。值，使0D值在0. 3-0. 7间，再用公式"蛋白浓度=1. 450D28Q-0. 740D26Q"计算出稀释 后的浓度，最后乘以稀释倍数，获得纯化病毒含量。
[0026] 1. 2动物免疫
[0027] 取适量的病毒液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射6周龄BALB/ c小鼠，每只0.2ml ;2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一 次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。
[0028] 1. 3 融合
[0029] 将加强免疫后3天的小鼠，眼眶采血作为阳性血清，颈脱臼将小鼠致死，无菌打开 腹腔取出脾脏，用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。选择生长状态良好的 骨髓瘤细胞（SP2/0细胞）和制备好的脾淋巴细胞按1:5混合在一支融合管中，lOOOrpm离 心lOmin，弃上清。将融合管置于手掌中，