分泌抗小麦黄花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
【背景技术】
[0002]小麦黄花叶病(Wheat yellow mosaic disease)，亦称“梭条花叶病”，是我国小麦生产中的一类重要土传病毒病害。小麦黄花叶病是由小麦黄花叶病毒(WYMV)引起的。我国20世纪60年代以前该病毒病只是零星发生，70年代由于感病品种的大量种植导致该病害在我国小麦种植区发生、流行，目前，该病主要分布于我国长江、黄河中下游和淮河流域，包括四川、陕西、江苏、浙江、安徽、湖北、山东和河南等省，其中江苏省的里下河地区和宁镇扬丘陵地区、湖北省东北沿大别山地区、陕西省渭河流域关中地区及山东省等地区发生较重。1991年河南潢川小麦黄花叶病发病面积达2.33万公顷，绝产3000公顷；2005年仅江苏省发病面积达4.636万公顷；2011年初步统计全国发病面积约50万公顷，目前全国发病面积达200万公顷。一般病田减产10%-30%，严重的达70%-80%，一些发病严重田块甚至绝收。目前，该病毒病已成为我国小麦生产上继黄矮病之后的又一重要病毒病害。
[0003]该病毒由禾谷多黏菌{Polymyxa graminis)的游动孢子携带传播，并可在土壤内的休眠孢子中长期存活，据文献报道其可持续存活十多年并保持其侵染能力。电子显微镜观察表明，WYMV病毒粒体为长线条状，长度分为275-300纳米和575-600纳米两种，直径为13-14纳米。小麦感染黄花叶病毒，一般冬前不表现症状，到春季小麦返青期才出现症状。受环境影响，各地小麦黄花叶病的症状存在一定差异，但基本症状一致。发病初期，在新生叶片上出现淡绿色或橙黄色的梭形或椭圆形斑点，不久斑点扩大，相互合并，成为黄绿相间的花叶、斑驳或不规则条纹，严重者新叶皱缩，扭曲成畸形；发病后期，老叶从花叶转为坏死、黄枯，茎上有时也出现褪绿的线状条斑；感病小麦分蘖减少，根系发育不好，重者明显矮化，分蘖萎缩枯死，甚至整株死亡；成株期感病的小麦植株株型松散、矮小，穗短小，籽粒不饱满。初发病田常出现点片状发病中心，然后逐步扩展成片。小麦播种后即可被病毒侵染，能够在小麦根部检测到病毒，但是并不表现症状。翌年2-3月才在田间开始显现典型症状。每年春季，气温回升至约10°C时，该病就进入发病高峰期，4-15°C是病害显症的最佳温度。当气温达20°C以上时，花叶症状逐渐消失，新叶表现为隐症，但是下部老叶片仍有明显的症状。
[0004]1969年Inouye确定小麦黄花叶病是通过土壤中的禾谷多黏菌进行传播。禾谷多黏菌是由Ledingham在1939年发现的属于根肿菌纲多黏菌属的一种低等专性寄生于禾本科植物的真核生物。该菌本身对寄主植物并无危害，但是可以传播包括小麦黄花叶病毒在内的多种麦类病毒，如大麦黄花叶病毒(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)，土传小麦花叶病毒(Soil-born wheat mosaic virus, SbWMV)，大麦温和花叶病毒(Barley mildmosaic virus, BaMMV)，中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaicvirus, CWMV)等。禾谷多黏菌休眠孢子萌发侵染小麦的最适土壤温度是15°C左右，土壤湿度大有利于休眠孢子萌发和游动孢子的侵染。在小麦苗期，病土和病残根里的禾谷多黏菌休眠孢子萌发成游动孢子，侵染麦苗根系组织，病毒随之侵入根部进行增殖和扩展。该菌产生的休眠孢子堆抗逆性极强，可以在土壤中存活至少20-25年。
[0005]目前，生产上对小麦黄花叶病尚无有效的防治措施。通过多年的研宄和实践证明，防控小麦黄花叶病应坚持“推广耐(抗)病品种为主，加强农业栽培综合管理”的防治策略。
[0006]本发明主要针对小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备展开工作。当前监测WYMV的体系尚不完善，甚至主要流行区也未开展相关预测预报的工作。目前用来检测这种病毒的方法主要是田间症状观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法。这几种方法都具有其局限性，而且不适合大批量的田间样品检测。而血清学的方法适于田间样品批量检测，但必须依赖于特异性的病毒单抗。目前，WYMV的血清学检测方法是通过制备抗血清，利用ELISA或Western blot对病毒进行检测和研宄。向荣等和韩成贵等分别制备了 WYMV Pl和CP的抗血清，可以通过ELISA或Western blot等血清学手段检测病毒；尚巧霞等建立了 WYMV ELISA检测系统。但这些以多抗建立的血清学方法由于其存在不足而未见其在田间样品大规模检测中应用的报道。因此，本专利利用杂交瘤技术制备了 I株能分泌抗WYMV单抗的杂交瘤细胞，并用其分泌的特异、灵敏的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，并成功应用于田间小麦黄花叶病毒的检测，从而为我国小麦黄花叶病的早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持，保证我国小麦的稳产增收。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。
[0008]分泌抗小麦黄花叶病毒单抗杂交瘤细胞4E11，能分泌抗小麦黄花叶病毒的特异性单克隆抗体，于2015年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101，保藏号为CGMCC N0.10415 ；
抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体腹水ELISA效价达10_7，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗检测病叶的灵敏度达到1:40960倍稀释；
抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体仅与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、土传小麦花叶病毒、大麦温和花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系、小麦矮缩病毒、宪菁花叶病毒、番前花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒反应;
抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
[0009]本发明与现有技术相比具有的有益效果:1)提供的杂交瘤细胞株分泌抗WYMV特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测小麦黄花叶病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测WYMV，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物中的小麦黄花叶病毒的检测、诊断。
【附图说明】
[0010]图1是dot-ELISA方法检测小麦黄花叶病毒的灵敏度分析；
图2是dot-ELISA方法检测田间小麦样品中小麦黄花叶病毒的结果。
【具体实施方式】
[0011]分泌抗小麦黄花叶病毒单抗杂交瘤细胞4E11，能分泌抗小麦黄花叶病毒的特异性单克隆抗体，于2015年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101，保藏号为CGMCC N0.10415 ；
抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体腹水ELISA效价达10_7，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗检测病叶的灵敏度达到1:40960倍稀释；
抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体仅与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、土传小麦花叶病毒、大麦温和花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系、小麦矮缩病毒、宪菁花叶病毒、番前花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒反应;
抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
[0012]本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗WYMV单抗，且其特异性强、灵敏度和效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测WYMV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并可应用于田间WYMV的检测，从而为我国小麦黄花叶病毒早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。
[0013]下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0014]一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫原及检测抗原的制备
WYMV的提纯方法参照Shir