一种利用无色杆菌降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，具体地，涉及一种利用无色杆菌降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法。
【背景技术】
[0002]邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAEs，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。其中，邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)是一种典型的邻苯二甲酸酯类物质，在人们日常生活中用途非常广泛，特别是作为塑料添加剂，在重量上可达20?50%。由于塑料制品中DEHP极易转移进入环境，从而广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。DEHP在邻苯二甲酸酯类物质中毒性最强，可以通过各种途径进入生物体内，严重干扰其内分泌、生殖及神经系统，并具有极强的致畸性、致突变性、致癌性。目前，DEHP已成为全球最普遍的污染物之一，并被美国国家环保局和中国环境监测总站列为优先控制污染物。
[0003]自然环境中DEHP的水解、光解和挥发速率非常缓慢，生物降解成为其从环境中消失的主要途径。但由于DEHP的侧链较长，尽管土壤中存在许多能降解DEHP的菌种，其自然降解能力也极弱，远远不能满足DEHP环境污染治理的需要。因此，对DEHP的处理有待于寻求高效降解菌。
[0004]目前对于微生物降解DEHP，国内外已经开展了大量研宄。例如，Kim等筛选分离出的一株尖孢镰刀菌，及Chao和Cheng等分离出的一株红球菌均对DEHP均具有良好的降解效果。但已报道的菌株对DEHP的降解速率还不能满足实际污染控制的要求，且有关能降解DEHP的无色杆菌种质资源鲜有报道。
【发明内容】
[0005]本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种降解邻苯二甲酸二异辛酯的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的:
一株无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2015058，保藏地址为:湖北省武汉市武汉大学，菌株分类命名为Achromobactersp.MT-H。
[0007]本发明所述无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H来源于广州市大坦沙城市污水处理厂的回流污泥，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌株对DEHP具有很高的降解效率，且在较宽的pH和温度范围内均能较好地降解DEHP，证明MT-H菌株可以作为优良的DEHP降解菌应用于DEHP污染的生物处理方面。
[0008]无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H在LB培养基上培养七天的菌落为圆形，微凸起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑。扫描电镜下多为球状或椭球状，直径为0.5—1 μ m0
[0009]无色杆菌{Achromobactersp.)菌株 MT-H 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:1所示，通过NCBI官方网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与Achromobactersp.相似性最高，同源率达99%。
[0010]一种降解DEHP的方法，将无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H接种到DEHP污染介质中，在pH5~10、温度为20~40°C条件下降解4天以上；所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2015058。
[0011 ] MT-H菌株在降解DEHP时的优选条件为在pH6~9、温度为30~40 V条件下降解4天以上。
[0012]优选地，MT-H菌株在降解DEHP时，将菌株MT-H制备成菌悬液接种到DEHP污染介质中。
[0013]更优选地，所述菌悬液的制备方法为将纯化后的菌株MT-H接入常规微生物液体培养基培养至对数期，离心收集菌体，用PBS洗菌后重悬调节0D_ ? = 0.8-1.2作为菌悬液。
[0014]更优选地，所述菌悬液的OD6qq M = 1.0o
[0015]优选地，所述常规微生物液体培养基为LB液体培养基、NA液体培养基或PDA液体培养基。
[0016]优选地，在制备菌悬液时，要用PBS洗菌2~4次。
[0017]将OD6tltl M = 1.0的MT-H的菌悬液用于降解DEHP时，菌悬液的用量根据污染介质中DEHP的浓度来确定，优选地，当DEHP的浓度为50~600mg L—1时，10mL的污染介质中加入l~5mL的0D_ M = 1.0的MT-H的菌悬液。
[0018]如上所述方法在修复DEHP污染介质中的应用。
[0019]优选地，所述介质为土壤或水。
[0020]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一种高效降解DEHP的方法，本发明将新分离得到无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H用于降解DEHP，并优化了菌株的降解温度和pH值，因为该菌株对DEHP具有很高的降解效率，且在较宽的pH和温度范围内均能较好地降解DEHP，因此，以该菌株建立的降解方法可以用于不同复杂环境中DEHP污染的生物修复。
【附图说明】
[0021]图1为MT-H菌在LB培养基上培养7天的生长形态特征。
[0022]图2为MT-H菌的扫描电镜照片。
[0023]图3为MT-H菌的16S rDNA的系统发育树。
[0024]图4为MT-H菌对不同浓度的DEHP的降解效果。
[0025]图5为MT-H菌在不同条件下(pH、温度和转速)对DEHP的降解效果。
【具体实施方式】
[0026]下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明的保护范围，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
[0027]实施例中所述培养基配方如下:
无机盐培养液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，FeCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最终 pH 为 7.5。
[0028]牛肉膏蛋白胨培养基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，加超纯水至1L，调节pH= 7.0 ;121°C灭菌20min。固体平板则添加1.5% (w/v)琼脂粉。
[0029]实施例1菌株的分离与鉴定
采集广州市大坦沙城市污水处理厂的回流污泥，称取5 g活性污泥样品于含有50 mL无菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培养3天后取5 mL污泥悬液加入到100 mL含有DEHP (50 mg I/1)的上述MSM培养基中。经30°C，140 rpm培养7天后，每次按取ImL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高培养基中DEHP的含量至1000 mg L'然后将转接10次的培养液稀释103~105倍涂布于LB固体平板上，30°C倒置培养1~3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号MT-H。然后将菌株接种于LB固体平板上30°C倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板培养7天的菌落成圆形，微凸起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑(见图1)。
[0030]扫描电镜样品制备与观察:将纯化后的菌株MT-H接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化。吸取800 μ L菌液经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入I mL的2.5%戊二醛充分混匀，4°C静置过夜。然后再次经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15 min，然后8000