在线工业鲁棒化调控细胞状态生产抗cd52单抗的装置与方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物工程领域中可在线调节和控制细胞状态生产抗⑶52单克隆抗体的装置与方法，尤其涉及一种可在线工业鲁棒化(industrially robust)连续监控、连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统的细胞培养环境中各项理生化指标，并可直接在线调节和控制细胞状态的细胞培养、扩增和制备抗CD52单克隆抗体的装置和方法。
【背景技术】
[0002]抗⑶52单克隆抗体，商品名Campath，是重组DNA转染的CHO细胞表达的抗⑶52人源化的单克隆抗体，具有人抗体构架区和恒定区及鼠源的互补性决定区(CDR)的IgGlkappa抗体。抗体构建是将抗人CD52鼠源单克隆抗体(rat YTH 34.5HL，Campath-1G)的重链和轻链的CDR分别插入到人的IgGl重链和轻链可变区，替换人源抗体的CDR。随后经过抗原亲和力和补体依赖细胞毒(⑶C)活性筛选，将重链可变区上框架区I (FRl)的Ser27突变为Phe、Ser30突变为Thr，从而获得抗原亲和力高的人源化抗体可变区片段。上述重链可变区片段与人IgGl的恒定区片段连接，轻链可变区片段与人K轻链恒定区连接，构建成重链和轻链的表载体，共转染宿主细胞，建立表达Campath (抗CD52单克隆抗体)的工程细胞株，细胞表达而获得蛋白。IgGl亚型被选择为构建Campath的基本构架是基于其优于其它IgG亚型具有更有效地定向激活ADCC和⑶C，有杀伤靶细胞的高活性。Campath保持了鼠源Campath-1G抗体结合抗原特点，而鼠源性组分的减少被预期降低鼠源抗体引发的人免疫原性反应，然而仍有一些病人在重复给药后会产生免疫原性反应。
[0003]Campath由1328个氨基酸组成,分子量约为150KD,含两条重链分子和两条轻链分子。其中轻链是由214个氨基酸组成，分子量约为24KDa;重链是由450个氨基酸组成，分子量约为49KDa。链内和链间共有12个二硫键，形成典型的Y型IgGl分子。每一条重链301位有一个能形成N-糖基的门冬酰胺残基及有糖链修饰，主要是以岩藻糖基化的寡糖链为核心的二分支型糖链结构，含I个或不含半乳糖残基。
[0004]Campath (抗⑶52单克隆抗体)生物学作用在于特异性识别细胞表面⑶52抗原。CD52抗原早期也称Campath-1抗原。在淋巴细胞分化过程中，淋巴细胞获得细胞表面表达⑶52抗原，单个细胞表面可表达约5xlOsCD52分子，构成抗体进攻淋巴细胞很好的靶点。⑶52由12个氨基酸残基组成，Asn-3是N-连接糖基化位点，抗原与细胞膜结合位点是C-末端Ser-12，通过糖脂键连接细胞膜。纯化的抗原组分不一致(糖基化)其分子量21_28kD，N-Glycanase或Pronase处理后,分子量减少至6kD。⑶52抗原分子非常小,并具有糖脂性，抗原决定簇靠近细胞膜，这些结构决定CD52抗原是很好的药物靶点。
[0005]Campath的糖基可能是决定抗体有无抗肿瘤活性的决定因素之一，与Fe区域功能有关。去糖基化的Campath或Campath的Fab片段无法取代Campath作用，表明CampathFab区域和Fe区域都是Campath功能必需的。
[0006]目前，Campath在美国由Genzyme公司生产，在欧洲则由Genzyme公司设在英国和爱尔兰的工厂以及德国拜尔先灵医药股份有限公司生产。
[0007]中国专利CN201210086437.2《用CAMPATH-1H治疗多发性硬化(MS)》中，发明人描述了用Campath-1H治疗多发性硬化(MS)的方法，所述方法具有明显的功效和有益的安全性，提供了可接受的效益/风险比，但是该专利没有提到详细的抗体制备工艺和方法。
[0008]就抗⑶52单克隆抗体的产业化工艺而言，现代动物细胞生物反应器培养表达技术是上述产品的关键核心技术，该技术工艺复杂、难度大。目前，抗CD52单克隆抗体的生产表达方法通常为采用批培养，分批补料培养等。这些重组蛋白生产工艺虽然已经被放大至1000L以上，但是工艺本身存在如下缺点:
[0009]I)培养，表达过程的参数控制较少，不能完全或只能部分程度的控制培养环境的理化条件如温度，pH, CO2和O2浓度，营养物质浓度等；
[0010]2)即使通过反应器对理生化条件进行精确控制，但这种控制方法仍然缺乏对细胞状态本身的精确调节和控制。处于生长和蛋白过程中的细胞状态可以极大地影响最终表达的重组蛋白质量(如蛋白质的糖基化水平，蛋白二级、三级结构的正确形成)，而细胞状态并不仅仅是通过上述理生化等参数对细胞的影响所能决定的，对于抗CD52单克隆抗体这样的蛋白来说，生产获得的蛋白活性更加是远远比单纯的蛋白质量重要；
[0011]3)批次培养获得的细胞的重复性较低，且极大地受到不同实验和生产技术人员个人操作的影响，在试验和生产中会出现较大的批次间差异(batch to batch variat1n),这也是目前药物品质控制和监管领域的难题之一。因此，一种具有简便可靠性的鲁棒化(robust)可大规模化(scalable)应用于工业化(industrial)的抗0)52单克隆抗体的生产装置和工艺是目前表达工艺(process development)研究领域的瓶颈。
[0012]此外，对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。据公开报导，细胞生长的状态与整个群体的细胞周期分布具有一定的相关性。按照细胞在分裂过程中表现出的显著性差异的行为，细胞周期可以大致分为三个阶段，参见图1:
[0013]gap I phase (G1 phase, Gl期)是一个细胞周期的起始阶段,在这个阶段,细胞内部进行相关蛋白质的合成等行为，细胞体积和基因组不产生任何变化；
[0014]随后，细胞会根据自身所处的环境来判断是否跨越过限制点(restrict1npoint),进入DNA合成期(DNA synthesis phase, S phase, S期),在S期,细胞主要进行自身基因组DNA的合成复制，复制完毕后，细胞成为2倍体，即基因组翻倍；
[0015]随后细胞进入有丝分裂期(gap 2/mitotic phase, G2/M phase, G2/M期),在此时期，细胞完成有丝分裂，得到两个相同的子细胞，完成了一个细胞周期；
[0016]当细胞所处环境不佳，不利于细胞生长时，细胞无法跨过限制点，从而跳出细胞周期，进入一个额外的沉默期(resting phase, GO phase),成为不分裂细胞。
[0017]根据细胞在上述不同周期的细胞行为，通过细胞核染色试剂检测细胞核的DNA含量，配合流式细胞仪即可分辨单个细胞所处的细胞周期并绘制整个群体的细胞周期分布图。
[0018]对于正常培养过程中的细胞而言，细胞整体是一个异步培养体系(asynchronousculture)，即在培养过程中细胞整体并不处于细胞周期的相同位置，而是随机分布在细胞周期的各个位置。由于处于细胞周期不同时期的细胞在蛋白过程中表现出的特性可能并不相同，因此细胞整体所呈现的结果可能实质上是由处于不同细胞周期、不同状态的细胞的所占比例的动态变化-即细胞周期分布导致的。
【发明内容】
[0019]由于细胞生长状态本身极大地影响最终表达的重组蛋白质量，而传统的细胞培养和蛋白表达方法如批培养和补料培养工艺中对于细胞状态的控制相对缺乏，同时细胞状态并不仅仅是通过上述理化参数对细胞的影响所能决定的。因此，实现对细胞生长状态(即细胞生长，细胞周期分布等具体参数)的精确控制，是建立具有简便可靠性的鲁棒化(robust)可大规模化(scalable)应用于工业化(industrial)抗0)52单克隆抗体表达工艺(processdevelopment)的重要工作。
[0020]本发明的目的在于，针对目前CD52单克隆抗体传统制备工艺中的上述缺点，提供一种既可在线、连续、监控细胞培养环境中多种理生化指标，又可以直接调节和控制细胞状态(包括细胞周期等)的生物反应器类细胞培养装置及由该装置生产抗CD52单克隆抗体的方法，使其降低染菌风险，维持细胞生长环境稳定，保持细胞恒定生长活力，达到高质、高效连续生产抗⑶52单克隆抗体的目的。
[0021]对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。本发明使用细胞比生长速率(μ )作为精确描述细胞生长的动力学参数，可以在一定程度上反映细胞状态。据发明人的研究结果，这一生长动力学参数与细胞周期分布、细胞在细胞周期内停留时间呈密切关系，通过特定装置组成联动系统调节，可以实现精确调控细胞状态的目标。
[0022]本发明的上述发明目的是通过以下技术方案实现的:
[0023]一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产抗⑶52单克隆抗体的装置，用以趋向性调节和控制细胞状态，该装置至少包括:培养液储存罐、可监控细胞生物反应器、产品收获罐、若干理生化指标检测器、在线监控系统、细胞状态调节控制装置及联动系统、细胞截留装置、若干流体无菌控速推动器和若干可控速管道体系，其中，所述培养液储存罐通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器与所述可监控细胞生物反应器连接，所述细胞截留装置连接所述可监控细胞生物反应器，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器选择性与所述可监控细胞生物反应器或所述细胞截留装置连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器连接所述产品收获罐，所述可监控细胞生物反应器通过所述理生化指标检测器连接所述在线监控系统，所述在线监控系统与所述流体无菌控速推动器连接并输送控速指令给所述流体无菌控速推动器，上述所有容器类装置均通过可控速管道体系进行连接，其中，所述细胞状态调节控制装置及联动系统用于所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。
[0024]优选地，所述细胞截留装置包括浓缩细胞出口和收获细胞出口，所述细胞状态调节控制装置及联动系统可择一与所述可监控细胞生物反应器的罐体、所述细胞截留装置的浓缩细胞出口或所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统至少包括三种工作联动方式:
[0025]第一种，当所述细胞状态调节控制装置及