特异性结合tm4sf5蛋白的新型单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及特异性结合跨膜4L六家族成员5(TM4SF5)蛋白的新型单克隆抗体，和 更具体地涉及特异性结合人TM4SF5蛋白的单克隆抗体、编码该单克隆抗体的多核苷酸、包 含该多核苷酸的表达载体、其中引入该表达载体的转化体、制备该单克隆抗体的方法、包含 该单克隆抗体的组合物、利用该单克隆抗体治疗癌症的方法、利用该单克隆抗体抑制癌症 肝转移的方法、利用该单克隆抗体诊断癌症的方法、和包括该单克隆抗体的癌症诊断试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 一般地，跨膜4超家族（TM4SF)蛋白是分子量为约25-50kDa、包括四个跨膜 结构域、两个胞外环和两个短胞质尾区的一类疏水蛋白质，也被称为四跨膜超家族蛋白 (tetraspanin或tetraspan)。TM4SF蛋白与细胞粘附分子如整合蛋白一起在细胞膜上形成 复合物，从而建立庞大的四跨膜超家族蛋白富集的微型结构域（TERM)并贡献于不同的生 物学功能，如细胞粘附、增殖、和迀移。
[0003] TM4SF5(跨膜4L六家族成员5或四跨膜L6超家族成员5)是四跨膜超家族蛋白 的成员，并且具有这样的结构：包括穿过细胞膜的不溶性蛋白质的四个结构域、存在于胞外 的两个环、存在于细胞质的一个环和两个尾。TM4SF5是肿瘤相关抗原L6(TM4SF1)的同系 物，并且已知TM4SF5的mRNA在胰腺癌、胃癌、结直肠癌、软组织肉瘤等的细胞中被高度过 表达。另外，已公开TM4SF5蛋白在COS7细胞中的人工表达可导致肌动蛋白重整和粘着斑 翻转（focal adhesion turnover)，因此表明其涉及细胞迁移（Lee SA等，J Clin Invest 2008,118(4) :1354-66)。另外，TM4SF5蛋白与L6--癌症相关基因--具有高的氨基 酸序列同源性，因此据说被怀疑是癌症相关基因，并且还已被报道与癌症发展和进程紧密 相关。TM4SF5涉及细胞增殖--通过促进G1/S周期进程经过胞内p27Kipl表达和RhoA GTP 酶活性（Kim H 等，Biochim Biophys Acta 20101803(8) :975-82)，并且在转化生长因 子-0 l(TGF-0 1)和表皮生长因子受体（EGFR)之间的信号传导途径中的相互通信一一上 皮-间质转化（EMT)涉及的主要因素--已知诱导TM4SF5的表达，从而引起EMT (Kang M 等，Biochem J 2012443(3) :691-700)。
[0004] 如上所述，随着作为新的癌症诊断的特异性蛋白质和抗癌靶的TM4SF5出现，研宄 已集中于以TM4SF为靶诊断癌症。另外，关于以TM4SF作为靶的癌症治疗，研宄已集中于在 不同领域抑制TM4SF5的生物学活性。具体地，已对可抑制TM4SF5活性的化合物进行了研 宄。例如，在查尔酮化合物中，磺胺-或磺酸基-取代的查尔酮衍生物已被报道抑制TM4SF5 的生物学活性（韩国专利号10-0934706)。除抑制TM4SF5的生物学活性的化合物外，还已 突出了研宄特异性结合TM4SF5的单克隆抗体的重要性。具体地，关于临床研宄，可用于通 过特异性结合TM4SF5,从而抑制TM4SF5的生物学活性来预防和治疗癌症的单克隆抗体的 研发需求升高。
[0005] 公开内容
[0006] 技术问题
[0007] 发明人在尝试寻找可特异性结合人TM4SF5蛋白并有效抑制TM4SF5蛋白的生物学 活性如癌转移的单克隆抗体时，研发了来自抗体库的特异性结合人TM4SF5的新型单克隆 抗体，并确认该抗体可有效抑制TM4SF5的生物学活性，从而完成本发明。
[0008] 技术方案
[0009] 本发明的一个目的是提供特异性结合跨膜4L六家族成员5 (TM4SF5)蛋白的单克 隆抗体。
[0010] 本发明的另一目的是提供制备该单克隆抗体的方法。
[0011] 本发明的再一目的是提供编码该单克隆抗体的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达 载体、和包括引入其中的表达载体的转化体。
[0012] 本发明的再一目的是提供包含该单克隆抗体的组合物。
[0013] 本发明的再一目的是提供包含该单克隆抗体的用于诊断癌症的试剂盒。
[0014] 本发明的再一目的是提供利用该单克隆抗体治疗癌症的方法。
[0015] 本发明的再一目的是提供抑制肝癌转移的方法，该方法包括给予该单克隆抗体至 疑患肝癌的对象。
[0016] 本发明的再一目的是提供诊断癌症的方法，该方法包括利用该单克隆抗体，通过 抗原-抗体反应，检测分离自疑患癌症的对象的生物学样品中的TM4SF5蛋白。
[0017] 有利效果
[0018] 根据本发明的TM4SF5-特异性单克隆抗体呈现对人TM4SF5蛋白的强亲和力，并且 通过结合TM4SF5的EC2区域有效抑制TM4SF5的生物学活性如诱导癌转移。因此，本发明 的TM4SF5-特异性单克隆抗体可有效用于诊断和治疗TM4SF5介导的疾病如肝癌。
[0019] 附图简述
[0020] 图IA是示例用于制备本发明的抗TM4SF5抗体的融合蛋白构建物--即，抗原蛋 白质构建物--的结构的图，其由TM4SF5的跨越EC2 (胞外环2)的第113至第157残基的 氨基酸区域、His-标签、凝血酶裂解位点（TCS)、免疫球蛋白Fc片段和Myc-标签组成；图 IB显示在表达和纯化后通过SDS-PAGE确认的抗原蛋白；和图IC显示示例本发明的抗体筛 选方法的流程图。
[0021] 图2显示对从HBX库淘选的96个克隆进行的噬菌体ELISA的结果，其中，在其之 间，20个克隆呈现对TM4SF5EC2的阳性反应。
[0022] 图3显示选定克隆的序列分析结果和抗体可变区的人种系免疫球蛋白的使用类 型。
[0023] 图4显示对具有相互不同序列的克隆#1、#16、#27、#28、#45、#46、#73、#79、#85、 #88和#92进行的ELISA的结果。
[0024] 图5显示本发明的抗TM4SF5抗体的抗原结合亲和力的分析结果。图5A和图5B 显示对照细胞系（Cp)的FACS分析结果；和图5C和图显示TM4SF5表达细胞系（Tp)的 FACS分析结果。另外，图5E显示蛋白质印迹分析结果。
[0025]图6显示通过亲和层析纯化本发明的五种抗体（#1、#27、#79、#88,和#92)的结 果，包括通过层析获得的抗体#79、#88和#92的结果和在定量后通过凝胶电泳确认的五种 抗体的结果。
[0026]图7显示通过FACS分析的本发明的抗TM4SF5抗体（#1、#27和#79)对于对照细 胞系（Cp)、TM4SF5过表达细胞系（Tp)、T3、17和T16的抗原结合亲和力的结果。
[0027] 图8显示利用本发明的抗TM4SF5抗体和一种阴性对照抗体（HAV)的免疫细胞化 学分析的图像。图8A显示利用阴性对照抗体（HAV)的免疫细胞化学分析的结果；图8B显示 利用抗TM4SF5抗体#1的免疫细胞化学分析的结果；图8C显示利用抗TM4SF5抗体#27的 免疫细胞化学分析的结果；图8D显示利用抗TM4SF5抗体#79的免疫细胞化学分析的结果； 图8E显示利用抗TM4SF5抗体#88的免疫细胞化学分析的结果；和图8F显示利用抗TM4SF5 抗体#92的免疫细胞化学分析的结果，其中Tp、I7和T16表示TM4SF5过表达细胞，和Cp表 示对照细胞。
[0028] 图9显示利用市售抗人TM4SF5多克隆抗体（Proteintech group 18239-1-AP)的 免疫细胞化学分析的结果。
[0029] 图IOA至IOC显示利用本发明的抗TM4SF5抗体和抗Flag抗体--对照抗体-- 在Flag-标记的TM4SF5 (Flag-TM4SF5)过表达细胞系中进行的联合免疫细胞化学分析的结 果。
[0030] 图IlA至IlB显示本发明的抗TM4SF5抗体对TM4SF5过表达细胞系（Tp)的侵入 的影响。
[0031] 图12显示通过抗TM4SF5抗体#1--本发明的代表性抗TM4SF5抗体--改变 Huh7肝癌细胞的迀移的结果。
[0032] 图13A至13B显示确认本发明的抗TM4SF5抗体对细胞迀移的影响的伤口愈合试 验结果。
[0033] 图14A至14B显示确认本发明的抗TM4SF5抗体对细胞生长的影响的结果。
[0034] 图15A显示利用#1抗TM4SF5抗体--本发明的代表性抗TM4SF5抗体--染色 患有CC14介导的肝纤维化的动物模型的肝组织的结果，和图15B显示通过FACS确认的、在 人Chang肝细胞中表达的TM4SF5蛋白是否被识别的图。
[0035] 最佳实施方式
[0036] -方面，本发明提供特异性结合跨膜4L六家族成员5 (TM4SF5)的单克隆抗体。
[0037] 如本文所用，术语"抗体"指代充当特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括与 特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子、和多克隆抗体、单克隆抗体、全抗体和抗体片 段。另外，该术语还包括嵌合抗体、人源化抗体、二价或双特异性分子（例如，双特异性抗 体）、双抗体、三抗体和四抗体。全抗体具有两个全长轻链和两个全长重链，并且每个轻链 通过二硫键连接至重链。全抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，并且IgG具有IgGl、IgG2、 IgG3和IgG4亚型。抗体片段指代具有结合抗原的功能的片段，包括Fab、Fab'、F(ab'） 2、 Fv等。Fab具有由轻链、重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区（CH1结构域）组成的 结构，并且其包括一个抗原结合位点。Fab'与Fab的区别在于其具有铰链区，该铰链区包括 重链CHl结构域的C端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab'）；^^体通过Fab'的铰链区的半 胱氨酸残基之间的二硫键形成。Fv(可变片段）指代最小抗体片段，其仅具有重链可变区 和轻链可变区。双链Fv(dsFv)具有这样的结构：其中重链可变区通过二硫键连接至轻链可 变区，单链Fv(ScFv)具有这样的结构：其中重链可变区通过肽连接体共价连接至轻链可变 区。这些抗体片段可利用蛋白酶获得（例如，Fab片段可通过用木瓜蛋白酶裂解全抗体而 获得，而F (ab '）2片段可通过用胃蛋白酶裂解全抗体而获得），优选通过基因重组技术。
[0038] 如本文所用，术语"单克隆抗体"指代由基本上相同的抗体克隆获得的、显示对特 定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体分子。
[0039] 一般地，免疫球蛋白具有重链和轻链，并且重链和轻链均包括恒定区和可变区 ('区'也被称为'结构域'）。轻链和重链可变区包括三个互补性决定区（在下文中，"CDR"） 和四个框架区（FR)。CDR主要用于结合抗原表位。各链的CDR -般被称为CDR1、CDR2、和 ⑶R3--自N端开始顺序，并且也通过具体⑶R所在的链来区分。
[0040]同时，单克隆抗体，以其在人体的应用为目的，可以是抗原性减少的嵌合或人源化 抗体的形式，如上所述。
[0041] 如本文所用，术语"嵌合抗体"指代通过DNA重组技术在小鼠抗体可变区和人抗体 恒定区之间获得的重组形式的抗体。嵌合抗体与小鼠抗体相比具有显著提高的免疫应答， 因此可被临床使用。
[0042] 如本文所用，术语"人源化抗体"指代以这样的形式制备的抗体：其中小鼠单克隆 抗体的CDR序列的部分或全部被嫁接至人抗体。例如，人源化抗体可通过如下获得：首先通 过在小鼠单克隆抗体的CDR和人抗体来源的FR之间进行重组制备人源化可变区，然后在所 得物和适当人抗体的恒定区之间重组，但不限于此。另外，考虑到仅小鼠源CDR的移植会降 低人源化抗体的亲和力，将可影响CDR的三维结构的FR氨基酸残基用小鼠抗体的氨基酸替 代，以提高人源化抗体的亲和力，但不限于此。
[0043] 如本文所用，术语"特异性结合