马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒遗传操作领域，更具体地，本发明涉及一种马立克氏病病毒弱毒 疫苗814株的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用。
【背景技术】
[0002] 马立克氏病（MD)是由马立克氏病病毒（MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋 巴组织增生和肿瘤形成为特征，外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞 浸润。MDV经空气传播，传染力很强，被感染鸡产生肿瘤和死亡，造成巨大经济损失。马立克 氏病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代以来最受重视的鸡病。
[0003] MDV属于细胞结合性疱瘆病毒，其基因组为线状双股DNA。MDV包括三种血清 型，血清1型病毒具有致瘤性，可进一步分为几个病理型，包括温和型MDV(mMDV)、强毒型 MDV(vMDV)、超强毒型MDV(vvMDV)及特超强毒型MDV(vv+MDV)病毒株。鸡的非致瘤病毒分 离株和火鸡疱瘆病毒分离株分别称作血清2型和3型MDV。当前现地用于MDV预防的疫苗 主要是血清1型弱毒疫苗，814疫苗株是其代表毒株之一。814疫苗株基因组全长约174kb， 该疫苗株自从上世纪80年代以来，安全使用30余年，无任何不良反应。814疫苗免疫效力 高，可以对vv+MDV产生良好的免疫保护效果。而且该疫苗株是一个自然弱毒株，具有十分 稳定的生物性状。因此，814疫苗株可以作为一个理想的载体，用于MDV活载体疫苗的研宄。
[0004] 常用的构建MDV重组病毒的方法主要有三种。一种是同源重组法，即将外源基因 插入到入门质粒中转染病毒感染细胞或并与病毒基因组共转染易感细胞。该方法构建过程 复杂费时而且效率较低，需要加入筛选标记基因并进行重组病毒的纯化。第二种是细菌人 工染色体（BAC)法，它是将完整的MDV基因组插入到BAC中并在细菌中对其进行改造。BAC 法是建立在同源重组基础上的，同样具有构建过程复杂、周期长的缺点。而且BAC自身序列 难以去除，使得后期获得的重组病毒带有不必要的外源基因序列。第三种是粘粒法。粘粒是 一种可以容纳30-45kb大小外源DNA的克隆载体，常用于基因文库的构建。该方法是将MDV 基因组分段插入到粘粒中，然后共转染易感细胞拯救重组病毒，具有操作简便、构建周期短 并易于进行改造的优点。其中Cosmid是一种传统的粘粒，它使用与质粒相同的复制子，其 较高的拷贝数使其所建文库稳定性较低，且具有一定的偏向性。而Fosmid是最近几年才 广泛用于基因文库构建的一种粘粒，具有稳定性好、无偏向性、拷贝数可诱导、构建周期短 以及操作简便等诸多优点，其构建的基因文库保真性和稳定性均比Cosmid好，是目前用于 替代 Cosmid 的新型粘粒（Vinayak, S.，Brooks, C. F.，Naumov, A.，Suvorova, E. S.，White, M. W. ,Striepen,B. Genetic manipulation of the Toxoplasma gondii genome by fosmid recombineering. MBio. 2014, 5 (6) : e02021.) D 应用 Fosmid 构建 814 疫苗株反向遗传操作 系统并用其进行重组病毒的拯救，可以为MDV活载体疫苗的研究奠定坚实的基础，具有重 要的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一在于提供一种马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作 系统。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种构建所述马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反 向遗传操作系统的方法。
[0007] 本发明的目的之三在于提供所述马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操 作系统在病毒拯救中的应用。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0009] 本发明的一种马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统，包含5 个分别依次含有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、 72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重组粘粒，其中所述 的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597。
[0010] 在本发明的一个具体实施例中，所述系统中的5个重组粘粒是通过将马立克氏病 病毒弱毒疫苗 814 株基因组 1-47873 位、40028-79118 位、72447-113806 位、106337-139612 位和129115-172541位核苷酸序列插入pCCIFos载体后得到的。
[0011] 进一步的，本发明还提出了一种构建马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传 操作系统的方法，其包括以下步骤：
[0012] 1)病毒培养及基因组提取
[0013] 将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株接种鸡胚成纤维细胞，待病毒生长至85-95% 的细胞产生病变时收集细胞，提取病毒基因组DNA，经脉冲场电泳鉴定；
[0014] 2)马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组Fosmid文库的构建
[0015] 将病毒基因组DNA用200微升移液器吸头抽吸多次进行打断处理，将打断后的DNA 片段进行平末端化和去磷酸化；经脉冲场电泳后，回收35-48kb之间的DNA片段；将回收产 物连接到pCCIFos载体上，室温孵育16-18h ;连接产物转染大肠杆菌，涂布于含氯霉素的LB 平板上培养过夜；
[0016] 随机挑取300个克隆，用碱裂解法提取粘粒，并用引物：pCCIF :5'-GGATGTGCTGCAA GGCGATTAAGITGG-3' 以及pCClR :5'-CTCGTATGITGTGTGGAAITGTGAGC-3'对所有粘粒进行末端 测序；根据粘粒末端测序分析，从中选取多组5粘粒组合，其中每组的5个重组粘粒均克隆 有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组DNA片段，能相互重叠并可拼接覆盖完整MDV基 因组；
[0017] 提取所选择的粘粒DNA，对提取的粘粒进行线性化处理，将线性化后的分别含有马 立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组DNA片段的5个粘粒组合转染次代CEF细胞，转染后 4h用15% (v/v)的甘油休克，休克后12h换含3% (v/v)胎牛血清，1% (v/v)双抗（100U/ ml青霉素+100 y g/ml链霉素）的DMEM继续培养4-6天，观察细胞病变情况；
[0018] 3)拯救毒rMDV的鉴定
[0019] 选取重复性较好的5粘粒组合，收取转染后出现细胞病变的细胞；进行透射电镜 检测，观察感染细胞的细胞核和细胞质中存在的MDV病毒；提取病毒全基因组DNA，对拯救 毒rMDV和原马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的基因组进行酶切鉴定；对拯救毒rMDV主要 结构蛋白基因以及5粘粒结合部位进行测序，并与原病毒基因组序列进行比对，得到拯救 病毒rMDV的基因序列与原病毒完全一致的5粘粒组合。
[0020] MDV是一种严格的细胞结合性病毒，提取纯度较高的MDV基因组DNA十分困难。为 了获得纯度较高的MDV基因组DNA用于Fosmid文库的构建，本发明在用细胞透化液和细胞 核缓冲液破碎细胞的基础上，加入微球菌核酸酶以降解细胞DNA(而病毒DNA因核衣壳的保 护不会被降解），与传统方法相比，提高了所提取的病毒基因组DNA的纯度。另外，在提取过 程中，本发明采用了高转速离心（32000rpm)以使病毒粒子得到更好的沉淀，与传统方法采 用的低转速（3500rpm)相比，提高了病毒基因组DNA的获取量。
[0021] 在本发明中，优选的，所述的提取病毒基因组DNA是按照以下方法进行：将感染 细胞反复冻融三次，将细胞和上清于32000rpm离心45min，弃上清；将沉淀用10mL细胞透 化液重悬，冰浴lOmin ;32000rpm离心45min，弃上清；将沉淀再次用细胞透化液重悬，冰浴 lOmin ;32000rpm离心45min，弃上清；将沉淀用5mL细胞核缓冲液重悬，加入500 y L 10 X 核酸酶缓冲液、50 y L 100XBSA、600U微球菌核酸酶和1 y L 100mg/ml的RNase A，混匀， 37°C作用lh ;加入55yL 0. 5M EDTA，37°C作用5min ;加入22mL裂解缓冲液和135yL浓度 为20mg/mL的蛋白酶K，50°C作用16h ;将裂解产物用等体积酚-氯仿-异戊醇抽提两次， 氯仿抽提一次，每次8000rpm离心5min，取上层清液；加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体 积无水乙醇， -20°C沉淀2h;15000g离心15min，弃上清；向沉淀加入lmL 70% (v/v)乙醇， 15000g离心10min，弃上清；将沉淀风干后用pH 7. 5100 y L Tris-HCl溶解，即得；
[0022] 其中，所述的细胞透化液为含有320mM蔗糖，5mM MgCl2，l% (v/v)Triton X-100的 10mM Tris-HCl, pH 7. 5 ；
[0023] 所述的细胞核缓冲液为含有2mMMgCl2 ? 6H20以及10% (w/v