一种甲酸脱氢酶的重组菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌及其 应用。
【背景技术】
[0002] 2, 3-丁二醇是一种重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及 航空航天等领域，具有生物降解性。2, 3- 丁二醇含有两个手性碳原子，因此具有三种旋光 异构体（分别为R，R-2, 3- 丁二醇、S,S-2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇）。R,R-2, 3- 丁 二醇除了具有上述用途以外，还是优良的抗冻剂，也是合成手性试剂、手性配体的重要中 间体，在手性药物和天然产物的合成中也有潜在的重要应用。目前，研宄发现能够代谢合 成R，R-2,3-丁二醇的微生物寥寥无几，而多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa， 前称Bacilluspolymyxa)是其中唯一具备工业化生产R,R-2, 3-丁二醇潜力的微生物。 P.polymyxa中的极少数菌株能够产菊粉酶，可以直接利用能源植物菊芋菊粉（菊糖）一步 法发酵制备高附加值的R，R-2, 3- 丁二醇。其中辅酶NADH作为还原当量起着关键的作用， 其含量的高低直接影响到2, 3- 丁二醇的产量，这些NADH主要是由菊粉氧化途径合成再生 的。因此，适当提高胞内NADH浓度及NADH/NAD比例，有望提高2, 3- 丁二醇合成浓度。
[0003] 由于辅酶NADH结构复杂、不稳定和价格昂贵等缺点，在工业生产中不断添加辅酶 NADH显然是不可行的，因而辅酶NADH的再生就成为降低生产成本的重要环节。近年来，甲 酸脱氢酶（FDH)辅酶再生系统引起了人们的广泛关注，并成功应用于L-叔亮氨酸的工业生 产。甲酸脱氢酶属于D-2-羟基酸脱氢酶类，广泛存在于甲醇利用型的细菌和酵母中。它可 以在催化甲酸转化为二氧化碳的同时将NAD+还原成NADH。本发明选择Candidaboidinii 作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了甲酸脱氢 酶的编码基因（fdh基因），PaenibacilluspolymyxaZJ-9作为宿主，成功构建了能够高效 表达甲酸脱氢酶的重组菌，提高了R，R_2, 3-丁二醇的产量，减少了副产物甲酸的含量，有 良好的工业应用前景。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于扩增甲酸脱氢酶的引物对。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌。
[0006] 本发明的第三个目的是提供一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌的构建方法。
[0007] 本发明的第四个目的是提供表达一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌在制备 R，R-2, 3- 丁二醇方面的应用。本发明的第五个目的是提供一种R，R-2, 3- 丁二醇的生产方 法。
[0008] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种用于扩增 甲酸脱氢酶的引物对，所述引物对包括两组：第一组引物对如下：
[0009]F1 ：5r -AGGCCGGGGCATATGGGAAACA-3r
[0010]R1 ： 5r -TAAGACTAAAACGATCTTCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTT-3r
[0011] 第二组引物对如下：
[0012] F2 ： 5r -AAGAATTAATAACAGAAGCTTATGAAGATCGTTTTAGTCTTA-3r
[0013]R2W-CCGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTACC-3^ 。
[0014] 一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌，它是以B.subtilis168基因组为模板以第 一组引物对进行PCR扩增得到获得的P43启动子片段，以假丝酵母Candidaboidinii的 基因组为模板以第二组引物对PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因片段fdh，再将获得的P43启 动子片段与甲酸脱氢酶基因片段进行重叠PCR，将重叠PCR获得的产物与质粒pMA5在T4 连接酶作用下连接得到重组质粒pMA5-P43-fdh，最后将重组质粒pMA5-P43-fdh电转入 P.polymyxaZJ-9 中获得重组菌P.polymyxaGX-1。
[0015] 一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：
[0016] 1)以B.subtilis168基因组为模板设计第一组引物对，如上述序列所示，PCR扩 增得到P43强启动子片段，切胶回收备用；
[0017] 2)以假丝酵母Candidaboidinii的基因组为模板，设计第二组引物对，如上述序 列所示，PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因片段fdh;
[0018] 3)将获得的P43强启动子片段与甲酸脱氢酶基因fdh进行重叠PCR;
[0019] 4)经限制性内切酶BamHI和NdeI双酶切，与经过同样双酶切的质粒pMA5在T4 连接酶的作用下进行连接得到重组质粒pMA5-P43-fdh;
[0020] 5)将重组质粒pMA5-P43_fdh电转入P.polymyxaZJ-9,获得重组菌P.polymyxa GX-l〇
[0021] 一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌在制备R，R_2,3-丁二醇方面的应用。
[0022] -种R，R_2, 3-丁二醇的生产方法，以上述的重组菌P.polymyxaGX-1在发酵罐中 发酵获得。
[0023] 其中，上述发酵培养条件为：温度30°C，通气量lvvm，装液量4L，接种量8%，前 22h转速为300r/min，后22h调为200r/min，pH调控策略为：发酵初期不控发酵液pH，待发 酵过程中随着pH值降到6. 0以下时，用4MNaOH调pH为6. 0。
[0024] 其中，上述发酵过程中活化培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，琼脂 10 ~20g/L，pH7. 0 ;种子培养基：菊粉 20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 3g/L，NaC15g/L，pH 7. 0 ;发酵培养基：菊粉 75g/L，酵母膏 6g/L，蛋白胨 2g/L，MgS04 ? 7H200. 5g/L，K2HP043.09g/ L，MnS04 ?H20 0? 001g/L，NH4C1 0? 93g/L，FeS04 ? 7H20 0? 04g/L，ZnS04 ? 7H20 0? 001g/L，pH 6. 0〇
[0025] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明通过将外源甲酸脱氢酶导 入P.polymyxaZJ-9中，实现该菌株的辅酶再生，最终提高R，R-2, 3-丁二醇的产量，减少副 产物甲酸的含量，有利于产物的提取分离，该方法操作简单，环境友好，重组菌适合大规模 的工业化生产。本发明的PaenibacilluspolymyxaZJ-9,通过NBS7. 5L发酵罐发酵结果 显示，001提高了3.9%，达到23.18/1，民1?-2,3-丁二醇产量提高了10.2%，达到36.8 8/1， 副产物甲酸含量由3. 3g/L降低为0. 9g/L。副产物甲酸含量的降低，有利于后期发酵液的分 离纯化，为R，R-2, 3-BD工业化打下基础。
【附图说明】
[0026] 图1P43,fdh基因片段胶回收后电泳图；
[0027] 图2重叠PCR扩增的P43_fdh片段电泳图；
[0028] 图3重组质粒构建流程图；
[0029] 图4重组菌P.polymyxaGX-1的验证电泳图。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于 本发明的保护范围。
[0031] 实施例1 :基因组DNA的提取
[0032] 用GenomicDNAPurification Kit (Takara，大连）分别提取处于对数生长期的 Candida boidinii(北京北纳凯创生物技术有限公司购买）以及B.subtilis 168(北京北 纳凯创生物技术有限公司购买）的基因组DNA，并用1% (10g/L)的琼脂糖凝胶电泳对所获 得的基因组DNA进行检测。
[0033] 实施例2:强启动子（P43基因）、甲酸脱氢酶（fdh基因）的克隆及载体的构建
[0034] 2. 1PCR扩增目的基因
[0035] 根据Genbank上已报道的B.subtilis168来源的强启动子（P43基因）序列，运 用VectorNTI软件设计下列两条引物：
[0036]Fl:5' -AGGCCGGGGCATATGGGAAACA-3'(下划线处为NdeI酶切位点）
[0037]R1 ：5r -TAAGACTAAAACGATCTTCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTT-3r
[0038] 以假丝酵母Candida boidinii的基因组为模板，设计引物如下：
[0039]F2 ：5r -AAGAATTAATAACAGAAGCTTATGAAGATCGTTTTAGTCTTA-3r
[0040]R2：5'-CCGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTACC-3r (下划线处为BamHI酶切位点）
[0041] 根据常规PCR反应体系及条件，PCR扩增得到P43启动子片段以及fdh基因片段， 1% (10g/L)琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，得出结论：P43启动子片段大小约500bp，fdh 基因片段大小约ll〇〇bp，均与预期结果一致，所以用DNA纯化试剂盒回收。结果如图1。
[0042] 重叠PCR反应分两步扩增，第一步体系如下：10XPCR buffer 2. 5yL，Mg2+2yL， dNTP 2 y L，待重叠片段模板各2 y L，Ex TaqDNA聚合酶0. 5 y L，加ddH20至反应总体积为 25 1^。扩增程序如下：95°〇退火41^11;941：558,651：408,721：1111111，循环5次 ；721：延长 2min〇
[0043] 第二步在第一步基础上再加入25yL反应物质，体系如下：10XPCRbuffer 5yL，Mg2+2yL，dNTP4yL，待重叠片段模板P43上游引物和模板fdh下游引物各2yL， ExTaqDNA聚合酶1yL，加ddH20至反应总体积为50yL。扩增程序如下：95°C退火4min; 94°〇508,55~60°〇408,721：1111111308，循环30次；721：延长10111111。重叠片段经过切胶回 收后的电泳图如图2所示，条带大小约为1600bp，表明已将P43启动子与fdh基因连接。
[0044] 利用pMA5质粒构建表达载体，流程图见图3。
[0045] 2. 2限制性酶切反应，纯化及连接反应
[0046] 对实施例2. 1获得的PCR产物与pMD18-T载体连接，将连接产物转化感受态细胞 E.coliJM109,将鉴定为阳性克隆的菌液（含Amp+LB培养基）送南京金斯瑞生物科技有限 公司测序。
[0047] 用对应的酶进行双酶切反应。本实验中，所用的限制性内切酶是NdeI和BamHI。 酶切体系为：T载体 50yL，BamHI2.5yL，NdeI2.5yL，10X缓冲液 10yL，ddH2035yL， 总体积100yL。将DNA纯化试剂盒纯化酶切后的PCR产物。
[0048