H9n2亚型禽流感病毒ns1基因缺失减毒活疫苗候选株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过反向遗传技术对H9N2亚型禽流感病毒（AIV)NSl蛋白长度 进行修饰构建广谱性J19N2亚型AIV减毒活疫苗的方法，主要涉及的AIV为BJ-94-like和 Y280-like谱系的毒株。
【背景技术】
[0002]H9N2亚型禽流感病毒呈世界性流行，自其于1994年在中国大陆鸡群首次分离后 广为传播，逐渐在我国形成了地方性流行疾病，给我国的养殖业造成了巨大的经济损失。除 感染家禽外，J19N2亚型AIV还能感染哺乳动物（猪和人等）。虽然H9N2亚型AIV感染人只 是引起亚临床或者轻微的临床症状，但J19N2亚型AIV能够与其他亚型禽流感病毒重组从而 产生新的致死人的流感病毒，如H5亚型禽流感病毒和H7N9亚型流感病毒。因此，H9N2亚 型禽流感的防控在公共卫生上也具有重要意义。
[0003] 疫苗免疫是防控禽流感的有效手段。然而由于AIV的基因组是分节段的RNA病毒 易发生重配，RNA聚合酶复制的低保真性易导致病毒的快速变异，因此，现有灭活疫苗对禽 流感防控效果并不理想。目前我国使用的全病毒灭活疫苗既有针对早期的毒株，如Ck/SH/ F/98和Ck/SD/6/96(BJ/94谱系）（LiC，YuK，TianG，etalEvolutionofH9N2influenza virusesfromdomesticpoultryinMainlandChina.Virology, 2005, 340:70-83) 〇 也有 针对近期的流行株（Y280 谱系）（ZhangY,YinY，BiY，etal.Molecularandantigenic characterizationofH9N2avianinfluenzavirusisolatesfromchickenflocks between1998and2007inChina.VetMicrobiol2012, 156, 285-293.)，免疫鸡群仍不 时有H9N2亚型Al的疫情爆发。实验室条件下，SPF鸡群接种早期毒株制备的灭活疫苗 后，使用当前流行的J19N2亚型AIV以滴鼻方式进行攻毒，仍会发生高水平的排毒（Sun Y,PuJ,JiangZ,etal.GenotypicevolutionandantigenicdriftofH9N2influenza virusesinChinafrom1994to2008.VetMicrobiol, 2010, 146:215-225.);而使用部分 流行株制备的灭活疫苗也不能很好地保护SPF鸡只抵御H9N2病毒的攻击（刘东，宫晓，刘 晓东，等.2013.H9N2亚型禽流感流行分析及疫苗毒株的筛选.中国动物检疫.2013. 30. (6) :45-50 ;万晓朋，曾显营，田国彬，等.H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选.中 国预防兽医学报.2010. 32 (4) : 277-280)。因此，研制针对不同谱系H9亚型AIV毒株具有交 叉保护性的疫苗迫在眉睫。
[0004] 与传统的灭活疫苗相比，减毒活疫苗能够诱导机体产生黏膜和细胞免疫应答，具 有交叉保护效果好的优势。而且，减毒活疫苗可通过喷雾或者饮水的方式免疫，使用方 便，大大降低了人力成本。以新城疫活疫苗为例，不需注射而仅用饮水就能快速、方便地 完成鸡只的大规模免疫（Senne DA, King D J，Kapczynski D R. Control of Newcastle disease by vaccination. Developments in biologicals, 2004, 119165-70. )〇-些石开宄 表明，通过阻碍或降低流感病毒的NS1蛋白的活性能够致弱病毒（Quinlivan M，Zamarin D，Garcia-SastreA，etal.Attenuationofequineinfluenzavirusesthrough truncationsoftheNSlprotein.Journalofvirology, 2005, 79(13):8431-9.ZhouB,Li Y，BelserJA.，etal.NS-basedliveattenuatedHlNlpandemicvaccinesprotectmice andferrets.Vaccine，2010, 28(50) : 8015-8025.)，且NS1 蛋白是非结构蛋白，对其进行改 造并不会影响病毒本身的抗原性。随着流感病毒反向遗传技术的发展和成熟，能够在体 外对病毒的毒力相关基因进行修饰而快速获得致弱的重组病毒，获得潜在的减毒活疫苗 候选株。本研宄中，我们以A/chicken/Taixing/10/2010(TX)株（ZhuY，Yang，LiuW，et al.ComparisonofbiologicalcharacteristicsofH9N2avianinfluenzaviruses isolatedfromdifferenthosts，Archivesofvirology，2015, 160:917-927)为母本，对 其NS1基因的长度进行不同程度的缺失，使得NS1蛋白分别保留73、100和128个氨基酸， 通过反向遗传技术拯救出3株H9亚型AIVNS1缺失株。测定缺失株的毒力和免疫效力，挑 选出毒力最低而同时又能保持免疫效力的重组病毒作为疫苗候选株，免疫鸡后观察其对不 同谱系H9亚型AIV攻毒提供的保护交叉保护作用。
【发明内容】
[0005]H9N2亚型AIV感染给养禽业造成了巨大的经济损失，目前主要使用H9N2亚型禽流 感灭活疫苗来防控该病。由于J19N2亚型禽流感灭活疫苗只能诱导产生较高的HI抗体，不 能提供细胞免疫和黏膜免疫，对易发生抗原变异的J19N2亚型AIV很难提供交叉保护，常常 发生免疫失败。因此，有必要研制出能诱导细胞、体液和黏膜免疫，产生交叉保护性的新型 弱毒活疫苗。
[0006] 以当前流行的Y280谱系的A/chicken/Taixing/10/2010 (TX)株为母本，对NS1基 因的长度进行不同程度的缺失，使得NS1蛋白分别保留73、100和128个氨基酸；野生型NS1 蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0. 12所示；上述保留73、100和128个氨基酸的序列分别是 SEQIDN0. 13、SEQIDN0. 14和SEQIDN0. 15。利用反向遗传技术拯救出3株H9亚型重 组AIV。测定重组病毒的毒力指标和免疫抗体产生情况，筛选出安全性好且免疫原性好的重 组病毒作为疫苗候选株，免疫鸡后评价其对不同谱系H9亚型AIV攻毒提供的保护作用，筛 选出能提供交叉保护的弱毒活疫苗。
[0007] 本发明所采用的技术方案是：H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选 株rTX-NSl-128,它是以A/chicken/Taixing/10/2010TX株为母本，对NS1基因的长度进行 缺失，使得NS1蛋白只保留了128个氨基酸；所述的128个氨基酸的序列如SEQIDN0. 15 所示。
[0008] 本发明进一步公开了rTX-NSl-128的构建方法，是以A/chicken/ Taix