一株具有抗甜瓜枯萎菌和抗甜瓜疫霉菌活性的植物乳杆菌ab-4及其应用
【专利说明】一株具有抗甜瓜枯萎菌和抗甜瓜疫霉菌活性的植物乳杆菌 AB-4及其应用 【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一株分离自蒙古国酸驼奶的植物乳杆菌菌株 (LactobacillusplantarumAB-4)，以及所述植物乳杆菌在发酵制品、生物农药或果蔬保 鲜剂中的应用。 【技术背景】
[0002] 植物的所有侵染性病害中，真菌性病害数量最为繁多，约占所有病害数量的70% 以上。甜瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusariumoxysporumf.sp.Melonis)引起 的病害，从苗期到生长发育期均可染病，常造成大片瓜田植株枯萎死亡，是危害甜瓜种植业 的重要土传病害。目前，化学防治是控制甜瓜枯萎病的主要措施，但是长期使用化学农药会 使病原菌产生抗药性，而且其化学残留和污染环境等弊端不符合现代社会所提倡的绿色无 公害广品。
[0003] 甜瓜疫霉病是由甜瓜疫霉菌（PhytophthoradrechsleriTucker)感染甜瓜植株 引起的真菌病害，甜瓜疫霉病是甜瓜生产上重要病害，一旦发病则难于控制。叶、茎和果实 均可被侵染。同样地，化学防治是目前控制甜瓜疫霉病的主要措施。因此，现有技术中缺乏 绿色、无公害的真菌病害防治方法。
[0004] 乳酸菌的抑菌机理主要表现在以下五个方面：一是乳酸菌产生乙酸、丙酸、乳酸和 苯乳酸等有机酸，使环境中的pH值显著降低且保持酸性，抑制不耐酸有害菌的生长繁殖； 二是乳酸菌产生抗生素或细菌素的蛋白质或肽类物质，对有害菌有抑制或杀灭作用；三是 乳酸菌产生的过氧化氢能激活过氧化氢酶一硫氰酸系统，抑制或杀灭有害菌；四是乳酸菌 产生的二氧化碳可抑制部分霉菌和革兰氏阴性菌；五是乳酸菌通过拮抗作用与有害菌竞争 营养物质，从而达到抑菌作用。
[0005] 然而，现有的乳酸菌大多只对大肠杆菌等常见致病菌具有抑制作用。《来源于酸马 奶的植物乳杆菌BX6-2抑制甜瓜疫霉菌的研宄》（《天津科技大学学报》25卷1期）公开了 一株具有抗甜瓜疫霉活性的植物乳杆菌Bx6-2,并公开了其对甜瓜疫霉抑制率达58%。然 而，并没有公开该菌株对于其他致病菌是否同样具有抑制活性。 【
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一株对多种病菌具有抑制活性的植物 乳杆菌，能够应用于多种作物病害的防治中，实现绿色、无公害的真菌病害防治，即生物防 治技术，具有无残留、无污染、成本低、兼防兼治、增产增收、保持生态平衡、能起到长效的效 果。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供一株具有抗菌活性的植物乳杆菌（Lactobaci1lus plantarum)AB-4,已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo. 9656。
[0008] 本发明还提供上述植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)AB_4在抗甜瓜枯萎和 甜瓜疫霉菌的应用。
[0009] 本发明还提供上述植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)AB_4在农药和果蔬保 鲜剂中的应用。
[0010] 本发明还提供上述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)AB_4在发酵制品中的 应用。
[0011] 以下将更详细地说明本发明的技术方案。
[0012] 在本发明中，将用到以下培养基：
[0013]MRS琼脂培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、 Tweeen801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、梓檬酸三胺2g、硫酸猛0. 02g、硫酸镁0.lg， 蒸馏水1L，调节pH至6. 2左右，琼脂15g，121°C、15min灭菌后倒到培养皿形成平板。
[0014]MRS液体培养基：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、梓檬酸三胺2g、硫酸猛0. 02g、硫酸镁0.lg，蒸馏水 1L，调节pH至6. 2左右，121°C、15min灭菌。
[0015]M17培养基的组成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2. 5g、抗 坏血酸0. 5g、硫酸镁0. 25g、二钠甘油19g、琼脂llg、蒸馏水1L。
[0016]TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋 白胨5g、磷酸氢二钾2. 5g、磷酸二氢钾2. 5g、硫酸镁0.lg、吐温800. 25g、L-半胱氨酸盐酸 盐 〇? 5g、蒸馏水 1L，121°C、15min灭菌。
[0017] 本发明的植物乳杆菌（L.plantarum)AB_4 是从酸蛇奶（fermentedCamelmilk) 中分离的新型植物乳杆菌，将采集的乳制品样品（酸驼奶）做梯度稀释后（10_4，10_ 5，10_6) 涂布于含有放线菌酮（〇?lwt%，0XID公司）和硫酸粘菌素（0?lwt%，0XID公司）的MRS琼 脂培养基或者M17琼脂培养基（0XID公司）上，30°C厌氧培养48h~72h，挑取单菌落，转接 于TPY增菌培养液中，30°C培养24h~48h，划线接种于MRS琼脂培养基，30°C培养24h~ 48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰 氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌，暂定为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体培养基中， 37°C培养24h~48h后备用。
[0018] 观察所得备用菌株形态学特性：细胞呈直杆状，有圆形末端，长3. 0-8. 0ym，宽 0. 9-1. 2ym，呈单个、成对，或短链状出现（见图1)，有些菌能减少硝酸盐，偶尔有些菌株表 现出拟过氧化氢酶活性。
[0019] 观察所得备用菌株的菌落形态特性：在MRS琼脂培养基上生长形成乳白色菌落， 不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1. 2-1. 5mm(见图2)。
[0020] 所得备用菌株的分子生物学鉴定：将冷冻保存的备用菌株接种于TPY增菌培养液 中，30°C恒温培养24h，经TPY增菌培养液传代培养2~3代后，取2mL对数生长末期的菌体 培养物置于无菌EP管内离心，经8000Xg离心3min(4°C)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌 专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
[0021] 采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichia coil8-27位碱基）： 5' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3 反向引物是1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基）：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16SrRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和 系统发育关系研宄进行种属鉴定，得到待筛选的菌株，其系统发育树状图（见图3)。
[0022] 制备植物乳杆菌上清液：
[0023] 把冻存的待筛选的菌株接种到5mL的MRS液体培养基中，震荡混匀，37°C恒温培养 24h，以2%的接种量连续活化三代，取第三代的发酵液以4000Xg离心lOmin，取上清，上清 液经0? 22um微膜过滤，-20°C冰箱保存备用。
[0024] 利用打孔法测定待复筛的植物乳杆菌的抗甜瓜枯萎活性：
[0025] 将在PDA(PotatoDextroseAgar)培养基（OXID公司）上活化好的甜瓜枯萎菌用 PBS缓冲液洗下来制成105的孢子菌悬液，把菌悬液按1% (V/V)接入PDA培养基中，震荡 混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
[0026] 在每个平板上用8_打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的测试编号，每 孔加入100yL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4°C冰箱中扩散12h后37°C培养恒温 48h，观测抑菌圈的大小。选取小孔周围有明显和较大抑菌圈（抑菌圈>30. 00