一种肠杆菌属菌株CV-v及其降解孔雀石绿的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于污水中染料降解技术领域，具体的说，涉及一种肠杆菌属菌株CV-V及 其降解孔雀石绿的方法。
【背景技术】
[0002] 孔雀石绿（MalachiteGreen,MG)，是一种极易溶于水的三苯甲烧类染料，可广泛 应用于印染、食品加工、医药、水产养殖和工业等各个领域中，尤其在水产养殖中，孔雀石 绿可作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂广泛用于预防与治疗水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。但 其广泛使用造成的负面效应，如对哺乳动物细胞、水生生物和其他有机生命体的致癌致 畸效应，也凸现出来，引起了科学界的广泛关注。因此，美国、日本、英国等许多国家和地 区，立法严禁使用孔雀石绿，且该染料已被美国食品和药物管理局（USFoodandDrug Administration)列为致癌性测试的优先化学物质之一，也被我国列入《食品动物禁用的兽 药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物。孔雀石绿在水生生物体中的主要代谢产物 为隐性孔雀石绿（leucomalachitegreen，LMG)，其残留毒性比孔雀石绿更强，对人们的健 康构成了潜在的巨大威胁。
[0003] 由于孔雀石绿本身或其降解产物的生物毒性较大，尽管许多科学工作者已致力于 解决由孔雀石绿造成的环境污染问题，例如应用吸附、化学沉淀、光降解、渗透和膜过滤等 理化处理技术处理污染水源；然而，由于这些处理方法不仅处理费用高、效率低，而且在治 污的同时容易产生二次污染和难以处置的底泥，因此，极大地限制了其广泛推广使用。生物 处理技术作为一种环境友好型且高效低耗的处理手段而受到越来越广泛的关注。其中，细 菌由于生长速度快，容易获得大量生物量，且易产生大量降解相关酶，对染料的降解效率也 较高等优势而受到环境工作者的青睐。
[0004] 以往的研宄显示，很多微生物被从环境中分离出来，测试其对孔雀石绿的降解行 为，这些微生物包括Chlorellasp.、Shewanellasp?和Pseudomonassp?等。已分离的菌 株对孔雀石绿的降解行为各异，但总体而言，降解效率仍差强人意，因此，仍有必要广泛筛 选孔雀石绿高效降解菌株，并研宄其降解行为等。同时，环境温度等因素对细菌降解孔雀石 绿的降解效果影响较大。然而，环境温度往往随季节变化显著，以浙江省为例，全省全年最 低气温可达零下3度以下，最高可达40度以上，加之实际含染料废水或过酸或过碱，这些因 素极大地限制了实验室筛选出的高效降解菌株在实践中的应用。要解决这一问题，就必须 加强筛选环境适应性更强或能更好的适应本地环境的高效降解菌株的研宄。
【发明内容】
[0005] 为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种肠杆菌属菌株CV-V，该菌 株能高效降解污水中的孔雀石绿。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种肠杆菌属菌株CV-V降解孔雀石绿的方法，能最 大化的发挥出菌株CV-V降解孔雀石绿的作用。
[0007] 本发明目的之一通过提供一种肠杆菌属（Enterobatersp.)菌株CV-v来实现，其 在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCN0:M2015177。
[0008] 本发明目的之二是这样实现的一种肠杆菌属菌株CV-v降解孔雀石绿的方法，其 关键在于由以下步骤组成：a、培养菌株：将菌株CV-v接种于LB培养基中，在30°C条件下， 于转速为180rpm的摇床中培养12-18h，以获得大量菌体；b、将经扩大培养后的菌体培养 物，将干重为0.1-0. 2g/L的菌体接种于孔雀石绿染料浓度为1000mg/L或以下的污染水体 中，并震荡培养6h以上，脱色pH范围为3. 0-10. 0,温度范围为10-50°C。
[0009] 优选地，上述步骤b中孔雀石绿染料浓度为600mg/L以下，震荡培养时间为6h。
[0010] 优选地，上述步骤b中孔雀石绿染料浓度为500mg/L以下。
[0011] 优选地，上述步骤b中温度范围为20~50°C。
[0012] 优选地，上述步骤b中震荡培养的转速为180rpm。
[0013] 优选地，上述步骤a中LB培养基由蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L配制 而成。
[0014] 一、肠杆菌属（Enterobatersp.)菌株CV-v
[0015] 一种肠杆菌属（Enterobatersp.)菌株CV_v，于2015年3月29日在中国典型培 养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2015177。
[0016] 肠杆菌属（Enterobatersp.)菌株CV-v革兰氏染色结果显不该菌株是革兰氏阴 性菌，短杆状，如图1所示。以菌株CV-v基因组为模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20进 行PCR扩增，检测PCR产物、回收、纯化后测序，获得1447nt的CV-v菌株的16SrRNA基因 片段，在GenBank中的登录序号为KF956722,序列如序列表所示。该序列经与GenBank中的 数据比对后发现，在系统进化树中该菌株与肠杆菌属（Enterobactersp.)聚类在一起，表 明菌株CV-v属于肠杆菌。
[0017] 二、材料和方法：
[0018] 1、培养基与试剂：
[0019] 孔雀石绿（MalachiteGreen，Xmax= 620nm)属于三苯甲烧类染料，购自国药集团 化学试剂有限公司。其它生化试剂均为国产分析纯。
[0020] 碳源影响实验培养基母液（pH7. 0,g/L) :Na2HP04,15. 13 ;KH2P04,3. 0 ;NaCl，0. 5 ; NH4C1，1. 0 ;MgS04 ? 7H20,0. 491 ;CaCl2 ? 2H20,0. 026。
[0021]氮源影响实验培养基母液（pH7. 0,g/L) :Na2HP04,15. 13 ;KH2P04,3.0;NaCl，0. 5 ; MgS04 ? 7H20,0. 491 ;CaCl2 ? 2H20,0. 026。
[0022] 其他因子影响实验培养基母液（pH7. 0)为2. Og/L的酵母粉溶液。
[0023] 1^培养基&117.0~7.2,8/1):蛋白胨，10;酵母粉，5;似(：1，10。
[0024] 2、菌株CV-v对孔雀石绿的脱色特性研宄
[0025] 2. 1碳、氮源对孔雀石绿脱色的影响
[0026] 将供试碳、氮源（葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、木糖和淀粉；氯化铵、 硝酸钠、牛肉浸提物、酵母粉、蛋白胨、谷氨酸和甘氨酸）分别添加至培养基中，使其终浓度 为2. 0g/L。灭菌后，添加已灭菌的终浓度为100mg/L的孔雀石绿，接种等量菌株CV-v过夜 培养物（菌体干重为〇. 1-0. 2g/L)，并于30°C、180rpm条件下震荡培养，定时取样测定。
[0027]2. 2pH值对孔雀石绿脱色的影响
[0028]用 1.Omol/L的HC1 或NaOH将培养基初始pH值分别调为 2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、 7. 0、8. 0、9. 0和10. 0。灭菌后，添加已灭菌的终浓度为lOOmg/L的孔雀石绿，接种等量菌株 CV-v过夜培养物（菌体干重为0.lg/L)，并于30°C、180rpm条件下震荡培养，定时取样测 定。
[0029] 2. 3温度对孔雀石绿脱色的影响
[0030] 设定温度梯度分别为10、20、30、40和50°C。培养基灭菌后，添加已灭菌的终浓度 为100mg/L的孔雀石绿，接种等量菌株CV-v过夜培养物（菌体干重为0. 1-0. 2g/L)，并于 180rpm条件下震荡培