一种重组金环蛇抗菌肽Cath-BF34及其高效制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肤药物技术领域。更具体地，设及一种重组金环蛇抗菌肤化th-BF34 及其局效制备方法。
【背景技术】
[0002] 瘦疮是一种常见的毛囊皮脂腺炎症性皮肤病，主要由厌氧性瘦疮丙酸杆菌所致， 目前主要采用抗生素治疗，但疗效不理想，并且可导致抗性菌的产生和超敏反应。新近研究 发现从金环蛇蛇毒中分离的抗菌肤化th-BF可在小鼠模型中有效抑制瘦疮丙酸杆菌及其 它瘦疮感染菌的生长，并抑制相关炎性增生，因此在瘦疮防治中具有重要的应用价值。该从 金环蛇蛇毒中分离的抗菌肤化th-BF属于第一个被报道的脊椎动物来源抗菌肤，天然分离 的化th-BF为30个氨基酸残基组成的多肤，因此可记作金环蛇抗菌肤化th-BF30。
[0003] 但是，根据金环蛇抗菌肤化th-BF的cDNA序列进行编码产物推断，该抗菌肤在 N端应该还有4个氨基酸残基，即天然长度应该为34个氨基酸残基，记作金环蛇抗菌肤 化th-BF34,但目前尚未有发现该结构形式的抗菌肤是否存在W及有无抑菌活性。
[0004] 在实际工作中，由于蛇毒来源有限，从中制备抗菌肤化th-BF30得率低，成本高， 更是未发现金环蛇抗菌肤化th-BF34的存在；而化学合成抗菌肤同样存在成本高的问题， 合成困难，价格昂贵，也难W推广应用。因此，开展对于金环蛇抗菌肤化th-BF34的研究，探 索一种高效制备天然化th-BF34的方法，不仅能为金环蛇抗菌肤化th-BF增加一个新成员， 对于化th-BF的推广应用也具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有金环蛇抗菌肤化th-BF相关研究和制备技 术的不足，提供一种新的金环蛇抗菌肤化th-BF34及其高效制备方法，成功构建了金环蛇 抗菌肤化th-BF34的毕赤酵母高效组成型分泌表达系统和表达产物分离纯化方法，并实验 证明了制备所得34肤化th-BF具有瘦疮杆菌抑制活性。
[0006] 本发明上述目的通过W下技术方案实现： 一种重组金环蛇抗菌肤化th-BF34,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 一种上述重组金环蛇抗菌肤化th-BF34的高效制备方法，是首先设计化th-BF34 基因序列如SEQIDNO. 2所示，再利用表达载体构建重组工程菌，工程菌在抑低于5的 条件下进行发酵后，经强阳离子SPSe地aroseFF柱进行分离纯化，得到金环蛇抗菌肤 化th-BF34。
[000引上述高效制备方法的具体步骤如下： 51. 设计化th-BF34基因，序列如SEQIDNO. 2所示，并合成该基因片段；具体是采用 毕赤酵母偏好密码子设计化th-BF34的编码序列，首尾分别加上酶切位点、终止密码子等， 采用引物重叠延伸PCR法（OverlapextensionPCR)合成目的基因； 52. 构建化th-BF34克隆载体；利用ZAoI与思aI双酶切，将合成的化th-BF34基因 片段克隆入毕赤酵母系统pGAPZa载体(合成的化th-BF34目的基因与分泌信号肤MF-a融合后克隆于启动子GAP的下游，W便在葡萄糖做基础碳源的条件下组成型分泌表达N端 为天然序列的抗菌肤)，获得重组表达质粒pGAPZa-Cath-BF34 ; 53. 构建化th-BF34毕赤酵母工程菌；通过电转化的方法，将重组表达质粒 pGAPZa-Cath-BF34转化毕赤酵母细胞，获得工程菌SMD-pGAPZa-34 ; 54. 发酵；在抑低于5、30°C条件下，W葡萄糖为碳源的YTO培养基进行发酵，200rmp震 荡培养7化； 55. 纯化；发酵上清经0.45ym滤膜过滤除去杂质后，采用强阳离子SPSe地aroseFF 柱进行分离纯化。
[0009] 其中，步骤S2构建克隆载体过程中，化th-BF34基因片段与pGAPZa载体的双酶 切产物是按照4:1的比例进行连接，所述连接的条件为16°C连接9小时。
[0010] 作为一种可实施方案，步骤S3所述转化是利用电转化的方法，获得的转化子依次 进行博来霉素筛选（由低浓度抗生素向高浓度抗生素画线）和丙酸杆菌抑菌斑筛选，再经过 PCR鉴定阳性，获得工程菌SMD-pGAPZa-34。
[0011] 优选地，步骤S3构建工程菌的具体方法如下： 531. 将重组表达质粒pGAPZa-Cath-BF34线性化后，电转化蛋白酶缺陷型宿主毕赤酵 母SMD1168感受态细胞； 532. 电转化后，先筛选博来霉素高抗性转化子，再取博来霉素高抗性转化子的培养上 清进行丙酸杆菌抑菌斑筛选，选取对丙酸杆菌的抑菌活性强的转化子； 533. 对S32筛选的抑菌活性强的转化子进行PCR鉴定，鉴定其是否含有化th-BF34目 的基因片段，阳性菌株即为工程菌SMD-pGAPZa-34。
[001引优选地，步骤S4所述发酵的接种量为1~5v/v% ;所述发酵的条件为抑=4~5、 28~30°C，170~200rmp震荡培养70~72h;所述YTO培养基是W葡萄糖为碳源的YTO培 养基。
[0013] 更优选地，所述发酵的接种量为1%，所述发酵的抑为4,发酵温度为30°C。
[0014] 步骤S5所述发酵上清需要先经过4000~5000rmp离屯、20~30min后，取上清， 加水稀释至与平衡液相同电导率，再用0. 45ym滤膜过滤除去杂质；所述平衡液为平衡SP Se地aroseFF柱用的平衡液；所述SPSe地aroseFF柱为强阳离子SPSe地aroseFF柱。
[0015] 另外，步骤S4发酵完成后，发酵上清用0.45ym滤膜过滤杂质，冷冻抽真空干燥， 并用双蒸水溶解冻干样，得到抗菌肤化th-BF34粗样品，96孔板法观察粗样品对瘦疮丙酸 杆菌厌氧培养物的生长抑制作用，即对所产生的抗菌肤化th-BF34进行活性分析，确认其 具有抑菌活性后，再进行步骤S5的纯化。该步骤在大规模实际应用时意义重大。
[0016] 优选地，步骤S31所述重组表达质粒pGAPZa-Cath-BF34利用公7/7I酶使其线性 化，并将完全线性化的质粒进行酪氯仿抽提，使其达到电转化所需的浓度； 步骤S31所述电转化的电击条件为1.化v、25yF、200欧；转化产物温育条件为30°C温 育比。
[0017] 更优选地，步骤S31所述电转化的具体操作如下： 将线性化的pGAPZa-Cath-BF34质粒加入毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，轻轻混匀， 置于在冰上提前预冷的0. 2cm的石英转化杯中lOmin，转化杯应在做转化前提前浸泡于75% 酒精，并于紫外灯下消毒半小时；擦干转化杯外壁的水，放于电转化仪槽中，1.5kv、25uF、 200欧，电击，立即加入1血预冷的山梨醇混匀，将转化产物置于30°C温育比。
[0018] 另外，更具体地，步骤S4所述工程菌SMD-pGAPZ a -34大规模发酵的方法具体操作 如下： (1) 挑取工程菌SMD-pGAPZa-34的单菌落接种至YTO培养基中，30°C震荡过夜，获得种 子液； (2) WIv/v%接种量，将种子液接种于YPD培养基中，30°C震荡过夜； (3) 进行高密度发酵，工作体积为化，转速，通气量，溶氧，pH(最适pH4~5)W及补料 (监控溶氧，当基础培养基中的糖消耗完时流加补料）都是由主控系统设置调节； (4) 每隔化测菌体湿重； (5) 7化收罐，离屯、取上清。
[0019] 本研究所构建工程菌为组成型表达系统的毕赤酵母体系，在发酵过程中不用加甲 醇进行诱导，只需流加葡萄糖，补料与溶氧相关联，参数如附图9所示，横坐标为发酵时间， 纵坐标为相对数值，如溶氧最大为100%，转速最大为700,在图中用70表示，温度为28~30°C 范围内，抑为4~5之间。当溶氧开始下降到一定程度开始上升时，本次实验为第18个小时， 基础培养基中的糖已经消耗完，此时需要流加补料，控制溶氧在30%左右，每六个小时测一 次菌湿重，如附图10所示，发酵至7化后收罐。
[0020] 根据上述高效制备方法制备得到的金环蛇抗菌肤化th-BF34也在本发明保护范 围之内。
[0021] 本发明首次证明了金环蛇抗菌肤化th-BF34的存在，并且首次采用基因工程手 段制备化th-BF34,并建立了高效的制备方法。采用毕赤酵母组成型分泌表达系统构建 化th-BF34的高效表达工程菌。所用毕赤酵母（Pichiapastoris)系统是最成熟的外源基 因高效表达系统，遗传背景清楚