研磨方法
【专利说明】研磨方法
[0001 ] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及一种处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化 为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品。另外，本发明还涉及一种酶组合物并且涉及本 发明的组合物的用途，该酶组合物包括一种或多种适于本发明的方法的酶活性。
[0004] 发明背景
[0005] 作为大部分作物（例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳）籽粒的重要成 分，在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖（例如右旋糖、果糖）、醇（例如乙醇）和增甜剂之 前，必须使淀粉可供使用并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理。如果淀粉包含多于 0.5%的杂质（包括蛋白质），则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料。为了从作物籽粒 开始提供这样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒，如将在下文进一步所描述。
[0006] 通常使用湿磨将玉米籽粒分离为其四种基本组分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。
[0007] 典型地，湿磨方法包括四个基本步骤。首先，将籽粒浸泡或浸渍约30分钟至约48 小时，以开始使淀粉和蛋白键断裂。该方法的下一步骤涉及粗磨，以破坏果皮并使胚芽与剩 余的籽粒分离。剩余的浆液由纤维、淀粉和蛋白质组成，将其细磨并筛选，以将纤维与淀粉 和蛋白质分离。在水力旋流器中将淀粉与剩余的浆液分离。然后，可以将淀粉转化为糖浆 或醇，或干燥并销售为玉米淀粉，或用化学方法或物理方法修饰以产生改性玉米淀粉。
[0008] 已经表明了酶对湿磨方法的浸渍步骤的用途。已经显示，商业酶产品 Steepzyme? (可获得自诺维信公司（Novozymes A/S))适于湿磨方法的第一步骤，即将玉 米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。
[0009] 最近，已经研发了"酶研磨（enzymatic milling) "，这是一种改性湿磨方法，该 方法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二 氧化硫的需求。约翰斯顿（Johnston)等人，谷物化学（Cereal Chem)，81，第626-632页 (2004)〇
[0010] US 6, 566, 125披露了一种用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉及将玉蜀黍籽 粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液 并用酶（例如，蛋白酶）孵育该经碾磨的玉蜀黍浆液。
[0011] US 5, 066, 218披露了一种研磨谷物（尤其是玉米）的方法，该方法包括清洗谷物， 将谷物浸渍在水中以将其软化，并且然后用纤维素酶研磨谷物。
[0012] WO 2002/000731披露了一种处理作物籽粒的方法，该方法包括将籽粒在水中浸泡 1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶（包括酸性蛋白酶）处理籽粒。
[0013] WO 2002/000911披露了一种分离淀粉面筋的方法，该方法包括使研磨淀粉经受酸 性蛋白酶。
[0014] WO 2002/002644披露了一种洗涤获得自研磨方法的淀粉面筋分离步骤的淀粉浆 液的方法，该方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。
[0015] 仍需要改进用于提供适于转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉的方法。
[0016] 发明概述
[0017] 本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸 泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在β -木糖苷酶的存在下处理 这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。
[0018] 在一个实施例中，本发明提供了 β-木糖苷酶用于增强一种或多种酶的湿磨益处 的用途。
[0019] 发明详细说明
[0020] 因此，本发明的目的在于提供处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的淀 粉。
[0021] 在一个实施例中，有用于本发明的方法的酶组合物提供以下益处，包括改进淀粉 产量和/或纯度，改进面筋品质和/或产量，改进纤维、面筋或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更 容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约。
[0022] 不希望受理论约束，诸位发明人已经发现木糖苷酶在湿磨中的用途并且具体 而言，与木聚糖酶组合使用木糖苷酶可以在例如淀粉和面筋产量方面提供显著增加。 相信使用β-木糖苷酶在从纤维级分中释放另外的淀粉和面筋方面是特别重要的，因此有 助于增加产量。
[0023] 这例如可以在成本和易用性的基础上为工业提供益处。
[0024] 酶的宙义
[0025] β -葡糖苷酶：术语" β -葡糖苷酶"意指一种β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。 出于本发明的目的，根据文丘里（Venturi)等人，2002,来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外 β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum:production, purification and some biochemical properties)，基础微生物学杂志（J. Basic Microbiol.) 42:55-66 的程序，使 用对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β -葡糖苷酶活性。一个单位的β -葡 糖苷酶定义为在25°C、pH 4. 8下，在含有0. 01 % TWEEN? 20的50mM柠檬酸钠中从作为 底物的ImM对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1. 0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
[0026] β -木糖苷酶：术语" β -木糖苷酶"意指催化短β - (1 - 4)-寡聚木糖的外切水 解，以从非还原末端除去连续的D-木糖残基的β -D-木糖苷木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 37)。 出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40°C、pH 5下，在含有0.01% TWEEN? 20的IOOmM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷每分钟产 生1. 0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
[0027] 纤维二糖水解酶：术语"纤维二糖水解酶"意指一种1，4_β-D-葡聚糖纤维 二糖水解酶（E.C. 3. 2. 1.91和E.C. 3. 2. 1. 176)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含 β -1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β -D-糖苷键水解，从该链的还原端或非还 原端释放纤维二糖（泰里（Teeri)，1997,晶态纤维素降解：纤维二糖水解酶功能的新 见角军(Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生物技术趋势（Trends in Biotechnology)15:160_167;泰里等 人，1998,里氏木霉纤维二糖水解酶：为何对晶态纤维素如此有效？（Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose ?)，生物化学学会 学报（Biochem.Soc. Trans. )26:173-1780。根据里弗（Lever)等人，1972,分析生物化学 (Anal. Biochem. )47:273-279 ;范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982,欧洲生化学会联合 会快报（FEBS Letters)，149:152-156 ;范?帝伯赫和克莱森斯（Claeyssens)，1985,欧洲生 化学会联合会快报，187:283-288 ;以及汤美（Tomme)等人，1988,欧洲生物化学杂志（Eur. J. Biochem.) 170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美 (Tomme)等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
[0028] 纤维素分解酶组合物、纤维素酶或纤维素酶制剂：术语"纤维素分解酶组合物"、 "纤维素酶"或"纤维素酶制剂"意指一种或多种（例如，若干种）水解纤维素材料的酶。 这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β -葡糖 苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：（1)测量总纤维素分解 活性，和（2)测量单独的纤维素分解活性（内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡 糖苷酶），如在张（Zhang)等人，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略（Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies)，2006,生物技术进展 (Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。通常使用不溶性底物，包括沃特曼 (Whatman) N2 1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等， 测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼N 2 1滤纸作为底物 的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC)(高斯（Ghose)，1987,纤维 素酶活性的测量（Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学（Pure Appl. Chem. )59:257-68)确立的。
[0029] 纤维素材料：术语"纤维素材料"意指含有纤维素的任何材料。纤维素是脱水纤维 二糖的均聚物，并且因此是一种线性β -(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如 具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露 聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶 体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
[0030] 内切葡聚糖酶：术语"内切葡聚糖酶"意指一种内切-1，4-(1，3 ;1，4)_ β-D-葡聚 糖4-葡聚糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物（如羧甲基纤维素和羟乙 基纤维素）、地衣多糖中的1，4-β -D-糖苷键和混合β -1，3葡聚糖如谷物β -D-葡聚糖或 木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β_1，4键的内切水解。可以通过测量 底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性 (张（Zhang)等人，2006,生物技术进展（Biotechnology Advances) 24:452-481)。出于本 发明的目的，根据高斯（Ghose)，1987,纯粹与应用化学（Pure and Appl. Chem.) 59:257-268 的程序，在pH 5、40°C下，使用羧甲基纤维素（CMC)作为底物，测定内切葡聚糖酶活性。
[0031] 家族61糖苷水解酶：术语"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61" 意指根据亨利萨特（Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化学杂志（Biochem. J. )280:309-316 ;和亨利萨特B.和贝洛赫 (Bairoch)A·，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分类（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志 316:695-696 属于糖昔水解 酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内 切-1，4-β -D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规 范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合 物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
[0032] 半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语"半纤维素分解酶"或"半纤维素酶"意指可 对半纤维素材料进行水解的一种或多种（例如，若干种）酶。参见例如，沙洛姆（Shallom)， D.和肖汉姆（Shoham)，Υ.微生物半纤维素酶（Microbial hemicellulases)，微生物学新见 (Current Opinion In Microbiology)，2003,6 (3) :219-228)。半纤维素酶是在植物生物质 的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于，乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚 糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛 酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。这些酶的底物 即半纤维素是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤 维键合，从而将它们交联成一个稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一 起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降 解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶（GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基 的酯键的碳水化合物酯酶（CE)。这些催化模炔基于它们一级序列的同源性，可以被分配到 GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族 (例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物 活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes) (CAZy)数据库中获得。可以根据高斯（Ghose)和 比萨拉（Bisaria)，1987,纯粹与应用化学（Pure&AppI. Chem.) 59:1739-1752,在适合的温 度（例如50°C、55°C、或60°C )和pH(例如5. 0或5. 5)下测量半纤维素分解酶活性。
[0033] 具有纤维素分解增强活性的多肽：术语"具有纤维素分解增强活性的多肽"意指促 进具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。在一个方面中，使用 在总蛋白质重量的2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶（根据WO 02/095014在米曲霉中重组 产生）或总蛋白质重量的2%-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶（如WO 2002/095014中所描述 在米曲霉中重组产生）的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下CELLUCLAST? I. 5L(诺维 信公司，巴格斯瓦尔德，丹麦）的混合物作为纤维素分解活性的来源。
[0034] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维 素分解酶的量降低优选至少1. 01倍，例如，至少1. 05倍、至少1. 10倍、至少1. 25倍、至少 1. 5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤 维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
[0035] 蛋白酶：术语"蛋白水解酶"或"蛋白酶"意指一种或多种（例如，若干种）酶，其 通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而分解蛋白质的酰胺键。
[0036] 木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语"木聚糖降解活性"或"木聚糖分解活 性"意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包 括：（1)测量总木聚糖分解活性，和⑵测量单独的木聚糖分解活性（例如内切木聚糖酶、 木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以 及α -葡糖醛酸酯酶）。