用于烃的生物氧化的遗传工程改造的微生物的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 关于序列表的声明
[0002] 与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且借此以引用的方式 并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是200206_408W0_SEQUENCE_LISTING. txt。 文本文件是1GB，在2013年10月14日创建，并且经由EFS-Web以电子方式提交。
[0003] 背景
技术领域
[0004] 本公开涉及用于烃的生物氧化，包括从烷烃产生醇或从烯烃产生环氧化物（诸如 从甲烷产生甲醇）的遗传工程改造的微生物，以及用于烃的氧化的方法和系统。
[0005] 相关领域的描述
[0006] 非常规气体是用于描述致密砂岩气、页岩气、气体水合物以及煤层甲烷的集合术 语。甲烷是天然气的主要组分（约75%)，其它成分包括乙烷、丙烷、丁烷（约20%)、更少 量的CO 2、氧气、氮气、硫化氢以及微量的稀有气体。将这些其它成分与甲烷分离以产生销售 级天然气。非常规气体与"常规"天然气是相同的物质；气储层的特定特征引出其"非常规" 名称。虽然可以在没有任何特殊完井的情况下开采常规天然气，但大多数非常规气体产生 需要岩石碎裂以允许气体通过钻井孔从岩石逸出至表面。非常规气藏占据北美有待被提取 的天然气的越来越大的比重。
[0007] 便宜的天然气资源的丰富度呈现了使用基于甲烷的燃料和化学品的机会，由此减 少对石油进口的依赖。然而，用于将天然气转化成更高价值的产品的传统催化工艺是高成 本的并且具有众多处理要求、环境条件（例如，高压和高温）以及安全问题。虽然生物转化 方法提供了一种潜在的替代方案，但先前策略，诸如使用原生的甲烷营养菌从甲烷产生甲 醇，对于商业使用而言提供了不足的工艺产率和低效率。
[0008] 鉴于与甲烷和天然气的其它组分转化成更高价值的燃料和化学品相关的限制，本 领域中明确需要安全、有效、专一、环保清洁并且有成本效益的新方法。本发明通过提供使 用遗传工程改造的微生物从烷烃以生物合成方式产生甲醇和其它醇产物的有效并且有成 本效益的方法来解决这一问题。此外，用于烷烃氧化的生物催化剂也能够将烯烃底物转化 成环氧化物，这是当前通过化学催化方法不足以达成的反应。 发明概要
[0009] 在一个方面，本公开提供了非天然存在的微生物，其包含：编码甲烷单加氧酶活性 的酶的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳定的；其中至少一种醇脱氢酶在微 生物中被灭活；并且其中这种微生物能够将甲烷转化成甲醇。在某些实施方案中，非天然存 在的微生物是甲烷营养菌。
[0010] 在某些实施方案中，微生物能够利用H2作为还原剂用于将甲烷转化成甲醇。在其 它实施方案中，微生物包含编码氢化酶的核酸，这种氢化酶能够利用H 2作为还原剂用于将 甲烷转化成甲醇。
[0011] 在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶是pMM〇、sMMO、AMO或P450。在某 些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶包含与SEQ ID ΝΟ:1-654中的任一者具有至少 70 %同一性的氨基酸序列。
[0012] 在某些实施方案中，化学或环境应激是>60 °C的温度、>9的pH或〈5的pH，或至少 60°C的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
[0013] 在某些实施方案中，醇脱氢酶通过遗传修饰被灭活。在其它实施方案中，醇脱氢酶 通过化学或环境应激被灭活。在某些实施方案中，化学或环境应激是至少60°C的温度、至少 9的pH、或者5或低于5的pH。在某些实施方案中，醇脱氢酶可以包括甲醇脱氢酶。在某些 实施方案中，醇脱氢酶包含与 SEQ ID N0:655、656、657、658、659、660、661、662、663、664 以 及665中的任一者具有至少70 %同一性的氨基酸序列。
[0014] 在某些实施方案中，微生物能够将乙烷转化成乙醇、丙烷转化成丙醇、丁烷转化成 丁醇或混合烷烃气体底物转化成混合醇产物。在一些实施方案中，混合烷烃气体底物是湿 天然气或其部分分离的衍生物。
[0015] 在某些实施方案中，微生物能够将乙烯转化成环氧乙烷、丙烯转化成环氧丙烷、丁 烯转化成环氧丁烷、丁二烯转化成丁二烯1，2氧化物或混合烯烃气体底物转化成混合环氧 化物产物。
[0016] 本公开还提供了将甲烷和其它低碳烷烃转化成其对应的醇、将低碳烯烃转化成其 对应的环氧化物的方法，以及包含非天然存在的微生物的系统。
[0017] 本公开的这些和其它方面将在参考以下发明详述和附图之后变得显而易见。本文 所公开的所有参考文献借此以全文引用的方式并入，如同每一者个别地并入一样。
[0018] 附图简述
[0019] 图1示出了如本公开中所提供的示例性甲醇生物合成途径，其显示将甲醇生物合 成分成两个依序进行的催化步骤以及对内源MDH和其它ADH活性的抑制。
[0020] 图2示出了一种示例性系统，其包括用于将烷烃底物转化成其相关的醇的气相生 物反应器，所述气相生物反应器含有固定的非天然存在的微生物的细胞物质；空气/O 2源和 连接器；气体底物源和连接器；H2源和连接器；化学或环境控制单元（例如，温度）；收集单 元（任选地包括冷凝器和/或蒸馏单元）；以及再循环单元。
[0021] 发明详述
[0022] 本公开提供了用于烃的特定氧化，包括混合气体底物氧化成混合氧化产物的组合 物、方法以及系统，其中微生物经过遗传工程改造以：包括编码具有甲烷单加氧酶活性的酶 的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳定的；并且具有至少一种在微生物中被 灭活的醇脱氢酶。如本文所提供，使烃氧化，包括将烷烃转化成其对应的醇或将烯烃转化成 其对应的环氧化物的方法包括提供遗传工程改造的微生物或来源于其的无细胞部分以及 使其暴露于：〇 2;包含低碳烷烃（例如，甲烷、乙烷、丙烷或丁烷）、低碳烯烃（例如，乙烯、丙 烯、丁烯或丁二烯）的气体底物或包含低碳烷烃和/或烯烃的混合气体底物；以及还原剂； 其中将烷烃随后转化成其对应的醇和/或将烯烃随后转化成其对应的环氧化物。可以将遗 传工程改造的微生物或来源于其的无细胞部分固定于固体基质上并且合并至包括气相生 物反应器的用于将烷烃转化成醇以及将烯烃转化成环氧化物的系统中。
[0023] 在更详细地阐述本公开之前，提供用于本文中的某些术语的定义可能有助于理解 本公开。额外的定义在本公开通篇阐述。
[0024] 在本发明描述中，除非另有指示，否则术语"约"意味着所指示的范围、值或结构的 ±20%。术语"基本上由……组成"将权利要求书的范围限制于指定的材料或步骤以及不 会本质上影响所要求保护的发明的基本和新颖的特征的那些。应了解，如本文所用的术语 "一（a/an)"指的是所列组分中的"一者或多者"。替代物的使用（例如，"或"）应被理解 为意味着替代物中的任一者、两者或其任何组合。如本文所用的术语"包括"和"具有"同 义地使用，这些术语和其变型意图被解释为非限制性的。术语"包含"意味着如权利要求书 中所提及的规定特征、整数、步骤或组分的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整数、步 骤、组分或其群组的存在或添加。
[0025] 如本文所用的术语"非天然存在"，也称为"重组"，当用于提及微生物时意味着这 种微生物具有至少一个遗传变异，所述遗传变异通常不会在所提及的物种的天然存在的菌 株中发现，包括所提及的物种的野生型菌株。遗传变异包括例如引入编码蛋白质的可表达 核酸分子、其它核酸添加、核酸缺失、核酸取代或细菌的遗传物质的其它功能破坏的修饰。 所述修饰包括例如所提及的物种的异源或同源多肽的编码区和其功能片段。额外的修饰包 括例如非编码调控区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。示例性蛋白质包括甲烷氧化途 径内的蛋白质（例如，甲烷单加氧酶）。对编码酶的核酸分子或其功能片段的遗传修饰可以 向从天然存在的状态改变的非天然存在的微生物赋予生物化学反应的能力或代谢途径的 能力或者提尚此类能力。
[0026] 如本文所用的术语"微生物"，也称为"微生物生物体"、"微菌"或"生物体"，指的是 来自古生菌（Archaea)、细菌（Bacteria)或真核生物（Eukarya)域的任何原核或真核微生 物物种。这个术语意图包括具有显微尺寸的原核或真核生物体。
[0027] 如本文所用的术语"甲烷营养菌"指的是专性甲基营养菌，其具有使作为其主要碳 源和能源的甲烷氧化的能力。
[0028] 如本文所用的"甲烷"指的是具有化学式014的最简单的烷烃化合物。甲烷是在室 温和室压下无色无味的气体。甲烷的来源包括天然来源，诸如天然气田，以及经由产甲烷微 生物生物合成，以及工业或实验室合成。甲烷包括纯甲烷；基本上纯化的组合物，诸如"管 道质量天然气"或"干天然气"，其为95-98%百分比甲烷；以及未纯化的组合物，诸如"湿天 然气"，其中其它烃尚未被去除并且甲烷占组合物的60%以上。
[0029] 如本文所用的"天然气液"，也称为"天然气相关烃"，指的是在进行处理以产生管 道质量干天然气期间从湿天然气中分离的各种烃（例如，乙烷、丙烷、丁烷）。"湿天然气的 部分分离的衍生物"包括天然气液。
[0030] 如本文所用的"具有甲烷单加氧酶活性的酶"指的是能够使甲烷中的C-H键氧化 以形成甲醇的任何酶。具有甲烷单加氧酶活性的酶可以对除甲烷以外的多种其它底物（例 如，乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯、丁烯或丁二烯）具有氧化活性。具有甲烷单加氧酶活性的 酶包括多组分酶以及包含活性位点的亚单元。示例性的具有甲烷单加氧酶活性的酶包括 pMMO、sMMO、氨单加氧酶以及P450。
[0031] 如本文所用的"稳定"当用于提及具有催化活性（例如，甲烷单加氧酶活性）的酶 和化学或环境应激时，意味着这种酶在暴露于化学或环境应激期间保留实质的活性，即，与 不存在应激条件的情况相比在应激条件下至少25%或更多的催化活性。如本文所用，提及 已经被遗传工程改造成在化学或环境应激存在下"稳定"的具有催化活性的酶也可能意味 着工程改造的酶在暴露于化学或环境应激期间与暴露于相同应激条件的野生型或参考酶 相比保留显著的催化活性（即，野生型或参考酶在暴露于应激条件期间与正常条件相比保 留小于25%的催化活性）。
[0032] 如本文所用的"化学应激"或"环境应激"指的是影响微生物正常代谢、存活的能 力，或来源于微生物的蛋白质或酶发挥功能的能力的化学或环境条件。
[0033] 如本文所用的"H2"，也称为"分子氢"，指的是无色无味的二氢气体。其为最小的气 体分子并且由两个质子和两个电子组成。
[0034] 如本文所用的"还原剂（reducing agent) "，也称为"还原剂（reductant) "、"还原 剂（reducer) "或"还原等效物"，指的是向另一物质贡献电子的元素或化合物。
[0035] 如本文所用的"醇脱氢酶"（ADH)指的是能够将醇转化成其对应的醛、酮或酸的任 何酶。醇脱氢酶可以具有能够转化至少几种醇底物的一般特异性，或可以具有接受一种或 两种醇底物的狭窄特异性。
[0036] 如本文所用的"甲醇脱氢酶"（MDH)指的是一种类型的醇脱氢酶，其催化甲醇转化 成甲醛。
[0037] 如本文所用的"甲醇"，也称为"甲基醇"或"木醇"指的是具有化学式CH3OH的无 色、水溶性的液体。
[0038] 如本文所用的"颗粒性甲烷单加氧酶"(pMMO)指的是膜结合的颗粒性酶，其在甲烷 营养菌中催化甲烷氧化成甲醇。PMMO包括多组分酶以及包含这种酶的活性位点的亚单元。
[0039] 如本文所用的"可溶性甲烷单加氧酶"（sMMO)指的是在细胞裂解物的可溶部分 (细胞质）中所发现的酶，其在甲烷营养菌中催化甲烷氧化成甲醇。sMMO包括多组分酶以 及包含这种酶的活性位点的亚单元。
[0040] 如本文所用的"P450"，也称为"细胞色素 P450"或"CYP"，指的是一组具有光谱底 物特异性的酶，其催化有机化合物的氧化，最通常是将氧原子插入有机底物的R-H键中的 单加氧酶反应。
[0041] 如本文所用的"仏还原剂"指的是分子氢（H2)，其充当电子供体以推动具有甲烷单 加氧酶活性的酶的催化。
[0042] 如本文所用的用于提及酶（例如，醇脱氢酶）的"被灭活"意味着这种酶与野生型 或参考酶相比具有小于25 %的活性。灭活可以通过遗传方法实现，诸如抑制转录或表达，或 通过使用环境条件实现，诸如高温。化学灭活可以通过高酸度或碱度、高盐浓度或暴露于特 定化学品来实现。
[0043] 如本文所用的"混合烷烃气体底物"指的是含有两种或更多种低级烷烃的混合物 (即，来自由甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷组成的群组的两种或更多种烷烃的任何组合）的气 态组合物。
[0044] 如本文所用的"混合醇产物"指的是含有两种或更多种低级醇的混合物（例如，来 自由甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇组成的群组的两种或更多种醇的任何组合）的组合物。混合 醇产物中的醇组成取决于被非天然存在的微生物氧化的混合烷烃气体底物的烷烃组成。
[0045] 如本文所用的"混合烯烃气体底物"指的是含有两种或更多种低级烯烃的混合物 (即，来自由乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯组成的群组的两种或更多种烯烃的任何组合）的 气态组合物。
[0046] 如本文所用的"混合环氧化物产物"指的是含有两种或更多种低级环氧化物的混 合物（例如，来自由环氧乙烷、环氧丙烷以及环氧丁烷组成的群组的两种或更多种环氧化 物的任何组合）的组合物。混合环氧化物产物中的环氧化物组成取决于被非天然存在的微 生物氧化的混合烯烃气体底物的烯烃组成。
[0047] 如本文所用的"丁烯（butylene) "，也称为"丁烯（butene) "，指的是具有式C4H8的 烃。取决于丁烷的起始同分异构体和自由键的位置，丁烯存在几个同分异构体。丁烯包括 例如1，1- 丁烯；1，2- 丁烯；2, 2- 丁烯；1，3- 丁烯；2, 3- 丁烯（顺式和反式）；1，4- 丁烯； 1，1_异丁稀；1，2-异丁稀；以及1，3-异丁稀。
[0048] 如本文所用的"丁二烯"，也称为" 1，3- 丁二烯"，指的是具有式C4H6的简单的共轭 二烯。"丁二烯"还可以包括1，2-丁二烯同分异构体。
[0049] 如本文所用的"外源"意味着将所提及的分子（例如，核酸）或所提及的活性（例 如，甲烷单加氧酶活性）引入宿主微生物中。分子可以例如通过将核酸引入宿主遗传物质 中来引入，诸如通过整合至宿主染色体中或通过引入核酸作为非染色体遗传物质（如在质 粒上）。当这个术语用于提及编码核酸的表达时，其指的是将编码核酸以可表达形式引入宿 主微生物中。当用于提及酶活性或蛋白质活性时，这个术语指的是引入宿主参考微生物中 的活性。因此，术语"内源"或"原生"指的是存在于宿主微生物中的所提及的分子或活性。 术语"嵌合"当用于提及核酸时指的是并非内源的任何核酸，其包含在自然界中不会一起被 发现的序列。举例来说，嵌合核酸可以包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源 于相同来源，但以不同于自然界中所发现的方式排列的调控序列和编码序列。术语"异源" 指的是来源于除了所提及的物种或菌株以外的来源的分子或活性，而"同源"指的是来源于 宿主微生物的分子或活性。因此，如本公开中所提供的包含外源核酸的微生物可以利用异 源或同源核酸或这两者。
[0050] 应了解，当外源核酸包括在微生物中时，如上文所论述，这种外源核酸指的是所提 及的编码核酸或蛋白质活性。还应了解，可以将这类外源核酸引入宿主微生物中的独立的 核酸分子上、多顺反子核酸分子上或编码融合蛋白的单个核酸分子上或其组合，并且仍视 为一种以上外源核酸。举例来说，如本文所论述，可以对微生物进行修饰以表达两种或更多 种编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸（例如，编码pMMO和AMO的核酸）。在将两 种编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸引入宿主微生物中的情况下，应了解，这两 种外源核酸可以作为单个核酸分子引入，例如在单个质粒上、在独立的质粒上，可以在单个 位点或多个位点处整合至宿主染色体中，并且仍视为两种外源核酸。类似地，应了解，可以 将两种以上外源核酸分子以任何所需的组合引入宿主微生物中，例如在单个质粒上、在独 立的质粒上，可以在单个位点或多个位点处整合至宿主染色体中，并且仍视为两种或更多 种外源核酸。因此，所提及的外源核酸或酶活性的数量指的是编码核酸的数量或蛋白质活 性的数量，而不是引入宿主微生物中的独立的核酸分子的数量。
[0051] 如本文所用的"核酸"，也称为多聚核苷酸，指的是由共价连接的亚单元（称为核 苷酸）组成的聚合化合物。核酸包括多聚核糖核酸（RNA)、多聚脱氧核糖核酸（DNA)，这两 者可以是单链或双链。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA以及半合成DNA。
[0052] 如本文所用的"无细胞部分"当用于提及非天然存在的微生物时指的是已经从细 胞中分离的部分（例如，细胞器、细胞质）。无细胞部分可以是相对未纯化的（例如，细胞裂 解物）。无细胞部分还包括通过差速离心分离的相对纯化的细胞器部分。
[0053] 如本文所用的"气相生物反应器"，也称为"气相反应器"，指的是支持生物活性环 境的制造或工程化的装置或系统，在这个环境中微生物或来源于微生物的无细胞部分接触 并催化气体底物。生物活性环境可以包含微生物生长或由微生物（即，甲烷单加氧酶活性） 或来源于所述微生物的催化活性无细胞部分进行的化学过程。微生物或来源于其的无细胞 部分可以被固定至反应器内的固体基质或固定至包括反应器本身的表面。
[0054] 如本文所用的"流化床反应器"，也称为"流化床生物反应器"，指的是填充床和搅 拌槽、连续流反应器的组合的生物反应器。在流化床反应器中，附着至粒子床载体的微生物 或来源于其的无细胞部分是通过流体（气体或液体）向上通过而悬浮以使得粒子床载体在 流体中自由地循环。流化床反应器具有极佳的传质和传热特征。
[0055] 如本文所用的"固体基质"指的是能够具有暂时或永久地附着于固体基质上、固体 基质内或固体基质背面的微生物或来源于微生物的无细胞部分的固体物质。固定的微生物 可以在固体基质的表面（例如，呈生物膜形式）上生长。固体基质支撑体可以呈多种形状， 诸如片、环、珠，并且可以包含许多材料，包括聚丙烯、砂、粒状活性碳、硅藻土以及陶瓷。
[0056] 非天然存在的微牛物
[0057] 在某些实施方案中，提供了非天然存在的微生物，其经过遗传工程改造以包含编 码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳定的，其 中至少一种醇脱氢酶在微生物中被灭活，并且其中这种微生物能够将甲烷转化成甲醇。
[0058] 转型指的是核酸（例如，外源核酸）转移至宿主微生物的基因组中，得到遗传上稳 定的遗传性。含有转型的核酸的宿主微生物被称作"非天然存在"或"重组"或"转型"或 "转基因"的微生物。宿主微生物可以选自在来自古生菌、细菌或真核生物域的任何原核或 真核微生物物种中产生的非天然存在的微生物。示例性细菌包括大肠杆菌（Escherichia coli)、产酸克雷伯菌（Klebsiella 〇1}^1:〇〇3)、产瑭泊酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产瑭泊酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes)、产瑭 ?白 酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens)、艾利特根瘤菌（Rhizobium etli)、枯 草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)、氧 化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobiIis)、乳酸 乳球菌（Lactococcus Iactis)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉 菌（Streptomyces coelicolor)、丙酮丁 醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)、焚 光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)以及恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida) 〇 示例性酵母或真菌物种包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces Iactis)、马克斯 克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、少根根霉（Rhizopus arrhizus)、米根霉（Rhizobus oryzae)、假丝 酵母属（Candida)、耶氏酵母属（Yarrowia)、汉逊酵母属（Hansenula)、毕赤酵母（Pichia pastoris)、球拟酵母属（Torulopsis)、红酵母属（Rhodotorula)以及解脂耶氏酵母 (Yarrowia Iipolytica)。应了解，任何适合的宿主微生物都可以用于引入适合的遗传修饰 (例如，编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳 定的）以产生如本说明书