针对分化簇3(cd3)的人源化的抗体的利记博彩app
【专利说明】针对分化簇3 (CD3)的人源化的抗体
[0001] 优先权声明
[0002] 本申请要求2012年6月14日提交的美国临时申请序列号61/659, 717的权益。前 述的全部内容通过引用并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及特异性结合人CD3 (分化簇3)的人源化的单克隆抗体，和其片段，任选 地包括至少可变区，所述可变区包括特定框架突变和特定CDR。本发明还公开了用于产生和 使用公开的抗体的药物组合物和方法。
【背景技术】
[0004] 涉及通过抗原特异性T细胞受体（TCR)的抗体诱导信号传导的免疫治疗策略 已经被显示改善自身免疫性和炎性疾病，其可能是通过调节对自身抗原的免疫应答。 0)3 (Cluster of Differentiation 3，分化簇3)是这样的受体的一个实例。特别地，注 射的抗CD3单克隆抗体（mAb)治疗已经被证明在预防和逆转NOD小鼠中糖尿病的发作 (Belghith等，Nat Med 9:1202-8,2003)和在治疗患有1型糖尿病的受试者中（Herold 等，N Engl J Med 346:1692-82,2002)有效。抗CD3抗体也逆转了 Lewis大鼠中的实验性 变应性脑脊髓炎（EAE)，对T辅助1型（Thl)介导的免疫性具有抑制效应（Tran等，Intl Tmmunol 13:1109-20, 2001) oOrthoclone 0KT3 (莫罗单抗_CD3 ;0rtho Biotech Products， Br i dgewater，NJ)是被批准用于治疗移植后的移植物排斥的静脉注射的鼠抗CD31 gG2a mAb (Chatenoud, Nat Rev Immunol 3:123-32, 2003)。注射 0KT3 后，CD3+T 细胞被从循环去 除，这在逆转在肾、肝和心脏移植接受者的皮质类固醇抗性急性移植物排斥反应中有效。开 发了对CD3特异性的人源化的mAb，其还对Fc γ受体具有减少的结合。这些人源化的抗体 包括 otelixizumab、teplizumab 和 visilizumabo
[0005] 美国专利号7, 883, 703 (Weiner等）公开了，抗⑶3抗体在口服或粘膜施用时用于 自身免疫性疾病的治疗中也是有用的。这样的口服或粘膜施用的成功包括在粘膜免疫系统 中的调节性T细胞（Treg)的活化，其转而导致了不希望的免疫系统的效应的改善或下调， 因此改善了或至少减少了自身免疫和炎性疾病的病理学。口服或粘膜途径相对于全身途径 施用抗⑶3mAb的优势是避免严重不良事件（AE)和与全身施用抗⑶3 mAb相关的泛发的免 疫抑制的能力。
[0006] 发明概述
[0007] 对于提供不具有免疫原性、适合口服或粘膜施用、具有改善的药学稳定性和具有 生物学活性的结合CD3的改善的mAb和抗体片段存在未满足的需求。
[0008] 为了产生结合蛋白⑶3的改善的人源化的mAb的目的，意外地发现了，在可变（V) 框架区（FR)中的特定突变与特定的互补决定区（CDR)序列的组合，产生了具有改善的性质 特别是生物活性和药学稳定性的人源化的mAb。这样的突变和CDR的组合之前从未被公开、 暗示、或预期。因此，提供了针对CD3的改善的人源化的mAb，以及包含其的药物组合物，以 及其用于治疗容易通过结合至CD3改善的疾病的方法，其中"治疗"还可任选地包括预防。
[0009] 根据至少一些实施方案，本发明提供了结合⑶3的mAb或其抗体片段，包括至少V 区，其中所述抗体或抗体片段包括SEQ ID NO: 1-6列出的6个CDR和包括特定的点突变的 人源化的FR，其使得所述mAb更加药学稳定和生物学活性。
[0010] 根据本发明的一些实施方案，所述的mAb包括人恒定（C)区。
[0011] 根据本发明的一些实施方案，所述的重（H)链C区选自以下组成的组：IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA 和 IgM。
[0012] 根据本发明的一些实施方案，所述的mAb包括含有Ser241Pro突变的人IgG4C区。
[0013] 根据一些实施方案，所述的人源化的FR包括相对于SEQ ID NO :7列出的H链V区 (VH)的序列的突变：Q5V、A9S、A12K、R13K、K38R、R40A、Q43K、K66R、S75T、T83R、S87T、T108L 和 L109V。
[0014] 根据一些实施方案，所述的人源化的FR包括相对于SEQ ID NO :8列出的轻（L) kappa(K)链V 区（Vk)的序列的突变：I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、T22S、S40P、T42K、 S43A、A60S、H61R、S70D、S72T、G77S、M78L、E79Q、A80P、A83F、S100G、L104V 和 N107K。
[0015] 根据一些实施方案，所述的人源化的FR包括相对于SEQ ID NO :7列出的VH区的 序列的突变：Q5V、A9S、A12K、R13K、M20V、K38R、R40A、Q43K、K66R、L69I、S75T、Q81E、T83R、 S87T、T108L和L109V;以及相对于SEQIDN0:8列出的Vκ区的序列的突变 ：QlE、I10T、 Ml 1L、A13L、K18R、V19A、M21L、T22S、S40P、T42K、S43A、A60S、H61R、R63S、S70D、S72T、G77S、 M78L、E79Q、A80P、A83F、S100G、L104V 和 N107K。
[0016] 根据一些实施方案，所述的mAb或其片段包括SEQ ID N0:9列出的VH链。
[0017] 根据一些实施方案，所述的mAb或其片段包括SEQ ID NO: 10列出的Vk链。
[0018] 根据一些实施方案，所述的mAb或其片段包括SEQ ID N0:9列出的VH链和SEQ ID NO: 10列出的V κ链。
[0019] 根据一些实施方案，所述的mAb或其片段包括根据SEQ ID NO: 11的全长H链和根 据SEQ ID NO: 12的全长L链。
[0020] 根据一些实施方案，所述的mAb包括与SEQ ID NO :9具有至少95%同一性的H链 序列和与SEQ ID NO :10具有至少95%同一性的κ链序列。
[0021] 根据一些实施方案，所述的mAb包括分别与SEQ ID NO :9和SEQ ID NO : 10具有至 少96%、97%、98%或99%同一性的VH和Vk链序列。每种可能性代表了本发明的独立的 实施方案。
[0022] 根据一些实施方案，所述的VH链是由包括SEQ ID NO: 13列出的序列的多核苷酸 所编码的。
[0023] 根据一些实施方案，所述的Vk链是由包括SEQ ID N0:14列出的序列的多核苷酸 所编码的。
[0024] 对于本领域技术人员明显的是，DNA密码子的冗余是指每个氨基酸是由一个或更 多个密码子编码的，这样在编码相同多肽的DNA序列中可以有至少30 %可变性。
[0025] 对于本领域技术人员明显的是，含有内含子的SEQ ID NO: 13和14的DNA序列，以 与不含内含子并也编码VH和VL的SEQ ID NO: 13和14的相同方式，仍编码所述的VH和VL 链。
[0026] 本发明的范围还包括包含FR中的特定突变和SEQ ID NO: 1-6的6个⑶R序列的 抗体片段。
[0027] 根据本发明的抗体片段包括至少所述抗体的V区。在一些实施方案中，抗体片段 选自以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab'） 2、scFv或dsFv抗体。
[0028] 根据另一方面，本发明提供包括如上所述的针对CD3的mAb作为活性成分，且任选 地包括赋形剂或载体的药物组合物。
[0029] 在一些实施方案中，所述的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂和/或载 体。在一些实施方案中，所述的药物组合物还包括其他活性或非活性成分。
[0030] 根据一些实施方案，所述药物组合物被配制为用于选自以下组成的组中的施用途 径：口服、粘膜、经鼻、鼻内、肺、舌下、含服、直肠、或阴道。
[0031] 根据一些实施方案，提供了适用于口服施用的药物组合物，其中所述组合物是 以选自以下组成的组的形式：液体口服剂型和固体口服剂型，例如，片剂、胶囊、小胶囊 (caplet)、粉剂、丸剂、颗粒剂、在小药囊（sachet)中的粉剂、肠溶包衣胶囊、肠溶包衣片、 肠溶包衣珠、包封粉剂、包封丸剂、包封颗粒和肠溶包衣软凝胶胶囊。
[0032] 根据一些实施方案，所述口服剂型是控释制剂。
[0033] 根据又一方面，本发明提供了编码针对CD3的mAb或其片段、链或结构域的多肽序 列的多核苷酸序列。
[0034] 根据一些实施方案，提供了包括SEQ ID N0:13列出的序列、或与SEQ ID N0:13具 有至少70%、75%、80%、85%、90 %或95 %同一性的序列的多核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO: 11 中的 mAb H 链。
[0035] 根据一些实施方案，提供了包括SEQ ID N0:13列出的序列、或与SEQ ID N0:13具 有至少90%同一性的序列的多核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO: 11中的mAb H链。
[0036] 根据一些实施方案，提供了包括SEQ ID NO: 14列出的序列、或与SEQ ID NO: 14具 有至少70%、75%、80%、85%、90 %或95 %同一性的序列的多核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO: 12 中的 mAb L(K)链。
[0037] 根据一些实施方案，提供了包括SEQ ID NO: 14列出的序列、或与SEQ ID NO: 14具 有至少90%同一性的序列的多核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO: 12中的mAb L(K)链。
[0038] 根据一些实施方案，提供了包括SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14列出的至少一种 序列、或与 SEQ ID N0:13 或 SEQ ID N0:14 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%或95%同 一性的序列的多核苷酸序列。
[0039] 本发明的范围还包括：包含编码本文所述的mAb或其片段的多肽的至少一种多核 苷酸序列的表达载体、以及包含这些表达载体或多核苷酸序列的宿主细胞和转基因动物。
[0040] 另一方面涉及包含编码本文所述的mAb或其片段的表达载体的重组宿主细胞。
[0041] 根据一些实施方案，所述宿主是表达mAb或其片段、链或结构域的杂交瘤细胞系。
[0042] 本发明的范围还包括包含至少V区的根据本发明的mAb或其片段用于治疗，例如 本文所述的病症或疾病，或用于制备药物的用途。
[0043] 另一方面提供了包括包含至少V区的根据本发明的mAb或其片段，用于治疗容易 通过结合CD3改善的疾病或疾患的药物组合物。
[0044] 根据一些实施方案，所述药物组合物还包括赋形剂、稀释剂或载体。
[0045] 根据一些实施方案，所述药物组合物被配制用于口服或粘膜施用。
[0046] 根据又一方面，本发明提供了用于治疗容易通过结合CD3改善的疾病或疾患的方 法，包括向需要其的受试者施用包括根据本发明的包含至少可变区的mAb或其片段的药物 组合物。
[0047] 根据一些实施方案，所述疾病是自身免疫或炎性疾病。
[0048] 根据具体实施方案，所述疾病是任何病因的肝炎。
[0049] 根据本发明的治疗可使用任何施用途径，包括但不限于选自以下组成的组的施用 途径：口服、粘膜、经鼻、鼻内、肺、舌下、含服、直肠、或阴道。
[0050] 根据一些实施方案，所述施用是通过口服或粘膜途径。
[0051] 根据其他实施方案，所述施用途径选自以下组成的组：经鼻、鼻内、肺、舌下、含服、 直肠、或阴道。
[0052] 根据本发明的药物组合物可以作为单独治疗施用，或与其他任何治疗剂的治疗一 起施用。根据本发明的药物组合物可与其他剂一起施用或单独地施用。
[0053] 本发明的范围还包括制备包含至少V区的针对⑶3的mAb或其片段的方法。
[0054] 可通过本领域已知任何适合的方法制备根据本发明的mAb或其片段。这包括从重 组宿主细胞、杂交瘤细胞或其他生物学系统分离，或合成生产。
[0055] 在一些实施方案中，根据本发明的mAb是通过包括以下步骤的方法产生的：
[0056] (a)产生人CD3相关抗原或片段、或包含CD3或片段的细胞、或其融合蛋白的制 品；
[0057] (b)用抗原或片段、或其融合蛋白或包含所述抗原的细胞免疫啮齿类动物，例如小 鼠；
[0058] (C)在所述小鼠的血清中检测特异结合性或阻断性Ab ;
[0059] (d)在来自所述小鼠的淋巴结细胞与骨髓瘤细胞之间产生杂交瘤，以产生Ab ;和
[0060] (e)用抗原特异性结合试验筛选杂交瘤。
[0061] 在一些实施方案中，用于产生抗体（Ab)的抗原是来自人或类人灵长类物种。
[0062] 在一些实施方案中，用于产生Ab的抗原是表达内源性或重组的全长抗原或抗原 的抗原性片段的原代细胞或细胞系、或全部或部分抗原和其他蛋白的融合蛋白，或所述抗 原是病毒样颗粒的部分。
[0063] 在一些实施方案中，用于产生Ab的抗原是在细胞表面上。
[0064] 作为步骤b)、c)和d)的替代选择，包括至少V链的抗原或其片段可通过对步骤a) 的抗原进行噬菌体展示以选择抗体序列而获得。
[0065] 现有技术中对抗⑶3 Ab已知的或设想的基本上所有的用途都可以通过本发明的 Ab来实现，其表示出具有比先前已知的Ab改善的生物学和药学特征。这些用途包括预防性 的（预防的）和治疗性的应用。
[0066] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通 技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的方法和材料的方法和材 料可被用于实践或试验本发明，合适的方法和材料在下面被描述。所述材料、方法和实施例 仅是示例性的，并且不旨在用于限制。本发明的其他特征和优点将通过下面的详细描述以 及权利要求书变得明显。
[0067] 附图简述
[0068] 图1 :编码嵌合抗体V κ (左）和VH(右）序列的pA