一种油菜茎基溃疡病菌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种油菜茎基溃疡病菌 Leptosphaeriamaculans的检测方法。
【背景技术】
[0002] 油菜莖基溃疡病（phomastemcanker)是油菜上最严重的真菌病害之一，其致 病菌为小球腔菌属的油菜莖基溃疡病菌（Leptosphaeriamaculans)。L.maculans致病力 非常强，能引起油菜茎基部发生溃烂，导致油菜茎基溃疡病严重流行和油菜产量损失的主 要原因。据估计，全世界因此病而造成油菜经济损失每年超过3亿欧元。该病原菌在欧 洲、澳大利亚、加拿大、美国等地广泛分布，目前在我国还未见报道，但我国油菜产区气候 与欧、美、澳三大洲相似。该病菌可以通过种子进行传播，随着国际贸易和种质资源交流日 渐频繁，病菌传入风险加剧。2007年，我国已将油菜茎基溃疡病菌L.maculans列为检疫 性有害生物。因此，提供一种便捷有效的方式检测L.maculans对于保护我国油菜生产安全 具有重要意义。目前，对于L.maculans的检测主要为聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR)法，但PCR检测操作复杂且耗时长，同时需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统 等昂贵的实验仪器以及分子生物学专业的操作人员，在适用性局限较大。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种快速检测油菜茎基溃疡病菌的方法，以实现对油菜茎基 溃疡病菌进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，从而弥补现有技术的不足。
[0004] 本发明首先提供一种检测油菜茎基溃疡病菌的环介导等温扩增引物组，包含有如 下的引物：
[0005] F3 引物L印-F3:5' -TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3，（SEQIDN0:1)、
[0006] B3 引物L印43:5' -AAATGTGCTGCGCTCCA-3，（SEQIDN0:2)、
[0007]FIP引物L印-FIP:
[0008] 5' -AAGGGGCGCAATGTGCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA-3，（SEQIDN0:3)、BIP引物 Lep-BIP:
[0009] 5' -TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCAAGGCGAG-3'(SEQIDN0:4)、
[0010] LF引物L印-LF:5，-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3'（SEQIDN0:5)、
[0011] LB引物L印-LB:5，-TTGGGTGTTTGTTCCACTTGG-3，（SEQIDN0:6);
[0012] 作为优选，L印-FIP的序列如下：
[0013] 5' -AAGGGGCGCAATCACCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA-3，（SEQIDN0:7)、
[0014] L印-BIP的序列如下：
[0015] 5' -TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCATCGCGAG-3，（SEQIDN0:8)。
[0016] 其中L印-FIP为5'端进行生物素标记，L印-LF的5'端进行异硫氰酸荧光素 FITC标记；
[0017] 本发明还提供一种检测油菜茎基溃疡病菌的方法，包括如下的步骤
[0018] 1)配制LAMP反应体系：各引物的终浓度为：内引物L印-FIP和L印-BIP各 I. 6ymol/L，外引物Lep_F3 和Lep_B3 各 0? 2ymol/L，环引物Lep-LF和Lep-LB各 0.8ymol/L;缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L、KCl10mmol/L，MgS04 8mmol/L,(NH4)2S04lOmmol/L,Tween20 0.1%,Betaine0. 8mol/L,dNTPs1. 4mmol/L；8U BstDNA聚合酶和lul样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25ul;
[0019] 2)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65°C， 扩增反应时间为15-90min。
[0020] 3)LFD检测：取8ul扩增产物加入100ulBuffer中混勾，然后将LFD试纸条浸入 取出的扩增产物中显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。不步骤3中所述的最 适反应温度为63°C，最适反应时间为35min。
[0021] 本发明所提供的油菜茎基溃疡病菌LAMP-LFD检测方法具有如下优点：
[0022] 一、灵敏度高，对油菜茎基溃疡病菌的检测极限可低至114fg/ml，其检测灵敏度比 常规PCR的检测高出10倍。
[0023] 二、特异性强，所用的特异性引物根据油菜茎基溃疡病菌的1ST基因中的六个不 同区域设计，其中LF同时为DNA特异性探针，特异性比常规PCR强。
[0024] 三、检测时间短，lh左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2-4h。
[0025] 四、仪器设备要求低，不需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需一个水浴锅即可 完成检测。
[0026] 五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍有分子生物学 基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，直接肉眼观察即可判断。
[0027] 六、对人身和环境更安全，检测过程不使用EB等有毒试剂。
[0028] 综上所述，本发明具有比现有技术用的PCR检测油菜茎基溃疡病菌的方法具有更 高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在实际生产中现场应用，有利于检测和控制油菜中 茎基溃疡病的爆发。运用本发明的方法对油菜籽进行检测，能有效的判断进出口中的油菜 籽是否含有油菜茎基溃疡病菌，这对保护我国油菜生产安全具有重要意义。
【附图说明】
[0029] 图1 :PCR_AGE检测油菜茎基溃疡病菌的灵敏度比较图、
[0030] 图2 :LAMP-AGE检测油菜茎基溃疡病菌的灵敏度比较图、
[0031] 图3 :LAMP-LFD检测油菜茎基溃疡病菌的灵敏度比较图、
[0032] 图1-3中，1泳道M为DL2000DNAmarker, 2泳道为阴性对照，3泳道为100 (菌浓度 II. 4ng/ul)，4-9 泳道依次为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 倍稀释的基因组DNA。
[0033] 图4 :PCR_AGE检测油菜茎基溃疡病菌的特异性图、
[0034] 图5 :LAMP-AGE检测油菜茎基溃疡病菌的特异性图、
[0035] 图6 :LAMP-LFD检测油菜茎基溃疡病菌的特异性图；
[0036] 图4-6中，1泳道M为DL2000DNAmarker, 2泳道为阴性对照，3-8泳道依次为链格 孢属、龙眼焦腐病菌、油菜茎基溃疡病菌、镰刀菌属、大豆北方茎基溃疡病菌、大豆南方茎基 溃疡病菌。
【具体实施方式】
[0037]环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)，其反 应依赖于具有链置换活性的BstDNA聚合酶，通过4个特异引物，在恒温条件下（65°C左右） 高效（30min-lh)扩增目标DNA。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧 光染料目测观察等方法。
[0038] 横向流动试纸条（lateralflowdipstick,LFD)是一种新的检测方法，反应中 FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧 光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏 度。LFD检测不需要特性设备以及EB等有毒试剂，操作者只需将终产物和试纸条浸入缓冲 液即可，操作简便，安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察，LFD试纸条上 有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色、检测带不显色表 明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷